生命早期应激对青春期雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的影响

张莹，马佳男，王佳丽，方靖漪，张长勇

(1.国家卫生健康委科学技术研究所，北京 100081；2.中国中医科学院，北京 100700)

随着医学研究从传统的生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转变，社会环境和精神状态等因素引起的心理应激与疾病发生以及转归的关系引起了研究者们的广泛兴趣。生命早期应激(Early life stress，ELS)指在子宫内或出生后早期遭受的刺激，其往往能导致成年后行为表型的异常[1-2]。既往研究发现，ELS造成模型动物下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)功能紊乱，并对模型动物的神经、内分泌、免疫系统以及精神行为造成远期的影响[3]。下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG)是调控机体生殖功能的神经内分泌系统[4]，ELS是否影响HPA轴进而影响生殖功能，尚未见研究报道。本研究利用大鼠ELS模型——限制筑窝材料和垫料(limited nesting model，LN)模型，观察ELS对雄性大鼠睾丸组织及性激素水平的影响，探讨ELS对青春期生殖系统的影响。

材料与方法

一、实验材料

1.实验动物：SPF级SD孕鼠购自北京维通利华实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。动物实验室温度保持为(22±2)℃，相对湿度保持为(60±10)%，屏障环境，孕鼠单笼饲养，自由进水和食物。本实验已通过伦理委员会实验动物伦理审查。

2.主要试剂和仪器：LN模型所用材料均为自制。网架为塑封铝架，下有支架，高2.5 cm，网格直径1 cm×5 cm，网架尺寸为20 cm×33 cm，与鼠笼长宽相同，保证母鼠及仔鼠置于网架上，不会掉漏。筑窝材料多层纱布为自缝制。光学显微镜(BX51，Olympus，日本)。皮质酮(cortisol，CORT)、促性腺激素释放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)和雌二醇(E2)激素放射免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

二、研究方法

1.动物分组与处理：孕鼠随机分为对照组(4只)和模型组(4只)，每只孕鼠产仔鼠8～14只，其中对照组母鼠共产出雄性仔鼠28只，模型组母鼠共产出雄性仔鼠26只，用于实验。对照组新生SD大鼠正常饲养。模型组新生SD雄性大鼠行ELS即LN模型构建[5]，并适当调整。具体过程如下：分娩当日记为PND0(postnatal day 0)，依此类推，出生后第2天为PND2。从PND2开始，对照组母鼠及其仔鼠置于笼内，笼内有标准数量的玉米皮垫料，并配有一块10 cm×10 cm的多层纱布，母鼠会将其撕碎，混同垫料构成一个巢穴供其饲养仔鼠。模型组母鼠及其仔鼠的笼内放入网架平台，平台下面是谷壳垫料，垫料高度不超过平台，母鼠及其仔鼠置于平台上，平台上放置5 cm×5 cm的多层纱布。有限筑窝材料和垫料妨碍母鼠筑窝，使其抚育行为不可预测、片段化，对仔鼠造成持续的慢性应激。应激持续到PND9，从PND10开始，两组大鼠的筑窝材料和垫料均恢复正常。PND2～14及PND16、PND18、PND21测量仔鼠体重及尾长，评估仔鼠生长发育情况。

2.旷场实验：实验装置为自制的80 cm×80 cm×40 cm立方形敞箱，周围各壁和底面涂为黑色，底面由白线划分为25块面积相等的正方形。实验在安静暗光的环境中进行，于PND21将28只对照组大鼠和26只模型组大鼠放入行为箱正中央格，计时5 min。将大鼠在后3 min内穿行的水平格数记为水平运动得分(穿越1格为1分)，两后肢站立的次数作为垂直运动得分(站立1次为1分)，并记录大鼠修饰动作次数及持续时间，每只动物仅检测1次。

3.血清CORT及性激素水平检测：旷场实验结束后第2天，取对照组大鼠15只，模型组大鼠13只，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，4℃，3 000 r/min离心15 min，分离获得血清，-20℃保存备用。采用放射性免疫法测定血清CORT含量。剩余13只对照组大鼠及13只模型组大鼠于PND42同方法麻醉取血，放射性免疫法测定血清GnRH、FSH、LH、E2和T含量。

4.取材及组织处理：于PND42取材剩余对照组大鼠13只及模型组大鼠13只，称量体重，麻醉后取大鼠双侧睾丸称重，计算睾丸指数。睾丸指数=睾丸湿重(g)/体重(g)×100%。一侧睾丸剔除被膜后，取1/2体积睾丸组织，多聚甲醛固定、石蜡包埋，做常规组织切片，HE染色，光学显微镜观察睾丸组织病理学改变。

三、统计学分析

结 果

一、ELS对大鼠体重及尾长的影响

统计结果显示，对照组与模型组PND2仔鼠的体重及尾长均无统计学差异(P>0.05)；PND2～9持续不良生活环境处理后，PND10模型组仔鼠体重及尾长均显著低于对照组(P<0.05)，且体重的显著性差异可持续到PND21(P<0.01)，尾长的显著性差异可持续到PND18(P<0.05)(表1)。

表1 对照组与模型组仔鼠的体重及尾长比较(-±s)

二、ELS对大鼠自主活动的影响

PND21时仔鼠行旷场试验。与对照组相比，模型组仔鼠水平运动得分和垂直运动得分显著下降(P<0.05)；修饰次数无显著变化，但模型组仔鼠修饰行为持续时间延长，差异有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 对照组与模型组仔鼠的自主活动比较(-±s)

三、ELS对大鼠睾丸湿重、睾丸指数及睾丸组织形态的影响

统计结果显示，与对照组相比，PND42模型组大鼠体重、睾丸湿重及睾丸指数均显著下降(P<0.05)(表3)。

表3 两组大鼠体重、睾丸湿重和睾丸指数的比较(-±s)

睾丸组织HE染色结果显示，PND42对照组大鼠曲细精管呈圆形或椭圆形，排列规则，曲细精管中生精细胞排列整齐，层次清楚，曲细精管间可见间质组织，富含血管和淋巴管(图1A、B)。模型组大鼠间质组织萎缩，间质细胞数量减小，生精小管间连接疏松，生精小管中出现空泡，生精细胞间间隙增加(图1C、D)。提示ELS造成了大鼠睾丸组织损伤。

图1 对照组(A、B)和模型组(C、D)大鼠睾丸组织HE染色

四、ELS对大鼠血清CORT及性激素水平的影响

PND22时，模型组仔鼠血清CORT含量(20.00±1.14)ng/ml，显著低于对照组的(23.14±2.46)ng/ml，差异有统计学意义(P<0.001)。

PND42时检测两组大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2和T含量。与对照组相比，模型组仔鼠血清GnRH和LH水平显著升高，而E2和T水平显著下降(P<0.05)；两组大鼠的血清FSH水平无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 两组仔鼠血清性腺激素水平的比较(-±s)

讨 论

生命早期机体比其他时期更容易受到环境有害因素的影响。本研究以新生雄性仔鼠为受试对象，应用经典ELS模型——LN模型观察ELS对青春期雄鼠性腺轴的影响。结果显示，LN模型大鼠睾丸指数显著下降，睾丸间质组织细胞数量减少，血清雄激素水平下降，初步结果表明ELS引起雄性大鼠生殖系统功能损伤。

一种合理稳定的动物模型对加深ELS的了解和认识非常必要。常见的ELS模型有母婴分离模型、母爱剥夺模型和限制筑窝材料和垫料模型。前两种模型广泛应用，增加了我们对ELS造成的远期影响的理解，但这两种模型在模拟ELS方面存在部分缺陷：首先，母婴分离的时间和年龄没有标准化；其次，母婴分离过程中没有母鼠的存在，幼崽的保暖和饮食会成为母婴分离应激以外的其他应激因素存在于造模过程中；再次，经历母婴分离的母鼠在回笼后会代偿性增加对仔鼠的抚育行为，这种行为变化很难通过实验来控制[6]。以上因素造成前两种模型所产生的实验结果出现分歧和矛盾。此外，来自人类的研究表明，经历战争、饥荒和忽视/虐待的幼儿，他们的母亲通常是存在的，只是行为不正常。因此，前两种模型不能很好的模拟人类的情况[5]。近年来提出的LN模型，通过限制筑窝材料和垫料，阻碍母鼠建造满意的巢穴，使母鼠的抚育行为片段化，不稳定。这种不可预测性的、片段化的抚育行为给仔鼠造成持续性应激。该模型能更好地模拟人类因早期生活贫困、生存条件恶劣所导致的母性抚育不良[7-8]。

体重是反映身体发育的良好指标，而尾长则是代表线性骨骼生长的指标[9]。应激仔鼠体重增加明显减少，尾长增长明显放缓，提示ELS致仔鼠身体生长缓慢，类似于儿童的发育不良。旷场试验是评价试验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种常用方法。PND21旷场试验结果显示模型组大鼠运动减少，修饰整理时间增加，表现出抑郁焦虑状态。血清CORT水平降低，提示大鼠HPA轴功能失调。这些结果进一步支持了LN模型大鼠在精神行为方面有重要改变，与既往研究[1-3]相符。同时也证实了该模型适用于本研究。

HPG是男性生殖系统的核心。下丘脑产生GnRH，刺激垂体产生FSH和 LH，作用于睾丸，启动生精功能，并促进T分泌及第二性征发育[10]。外周T水平又负反馈作用于下丘脑和垂体，调节内分泌激素，使得机体的激素水平相对稳定，维持正常功能发挥。睾丸间质细胞是T合成的重要场所，大约95%的T是在此合成的[11]。睾丸间质细胞有两种类型：胚胎期睾丸间质细胞和成年睾丸间质细胞。但胚胎期睾丸间质细胞不会向成年睾丸间质细胞转化，而是在出生后两周左右消失[12]。成年睾丸间质细胞来源于间质干细胞，睾丸间质干细胞分化为成年睾丸间质细胞的关键时期是幼鼠哺乳期[13]，在青春期时形成。青春期是身心发育的特殊时期，也是生殖系统发育成熟的关键阶段。雄性大鼠青春期的划分依据雄性前列腺袋皮肤皱褶分离的时间，约在出生后第35天开始[14]。本研究选取模型应激时间为哺乳期，观察青春期大鼠生殖系统变化。结果显示LN模型大鼠睾丸指数下降，睾丸间质组织萎缩，间质细胞数量减小，生精小管间连接疏松，血清T水平明显下降。提示ELS影响雄性大鼠睾丸间质细胞，造成雄性大鼠生殖功能受损；同时血清T水平明显下降，GnRH和LH水平升高，提示HPG轴功能失调。这些结果提示，ELS造成生殖系统损伤，HPG轴功能失调。

T的合成起始于胆固醇的转运，甾体激素生成急性调节蛋白StAR将线粒体外膜的胆固醇转运到线粒体内膜，在一系列酶的作用下转化为T[15]，T在酶的作用下可进一步转化为E2。T和E2可共同作用于机体，维持机体的生殖健康。本研究中LN模型组大鼠T水平下降，负反馈增加了血清GnRH和LH的水平，但是升高的GnRH和LH并没有实现调节T水平至正常值，而是T和E2水平均低于对照组，提示T和E2合成过程可能受阻，具体机制还需进一步探索。

综上所述，ELS造成雄性大鼠生殖系统损伤，HPG轴功能失调，具体机制待进一步探索。