猪肠道冠状病毒检测技术研究进展

韩 笑，王亚楠，姜金庆，范国英，李任峰，王自良

(河南科技学院 动物科技学院，河南 新乡 453003)

猪肠道冠状病毒(swine enteric coronavirus，SECoV)属于SECoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒表面有棒状突起，形似“日冕”或皇冠状，大小为70～200 nm[1]。SECoV基因组含有5’端的帽子结构和3’端的Poly(A)结构，编码四种主要结构蛋白，即纤突蛋白(Spike, S)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N)、膜蛋白(Membrane, M)、包膜蛋白(Envelope, E)[2-5]。由于其RNA具有较高的重组频率，导致病毒结构不稳定，容易变异。目前已知的SECoV主要包括猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastrogenteritis virus，TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)以及猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)[6-8]。

近年来，SECoV的流行与进化越来越复杂，毒株间和毒株内重组现象加剧，防控形势依然严峻[9]。本文就目前SECoV的核酸和免疫学检测方法进行综述，旨在为SECoV的防控提供参考依据。

1 核酸检测技术

1.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种通过体外扩增病原特定DNA序列从而对疾病进行诊断的分子生物学技术。该技术诞生于1985年，经过不断改进已衍生出多种体外扩增方法。Ding等[10]基于TGEV、PEDV和PDCoV的N基因、猪A型轮状病毒(porcine rotavirus A，PRoV-A)VP7基因以及猪库布病毒(porcine kobuvirus，PKV)和猪萨博病毒(porcine sapovirus，PSaV)的多聚蛋白基因建立了多重逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法，该方法能同时检测TGEV、PEDV、PDCoV、PRoV、PKV和PSaV六种猪肠道病毒，与猪的其他病原之间无交叉反应。随着技术的不断进步，荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的出现解决了普通PCR技术存在的难以定量、变异系数较大等问题。Pan等[11]针对PEDV、猪环曲病毒(porcine torovirus，PToV)和SADS-CoV的ORF1a区域以及PDCoV的ORF1b区域设计特异性引物和TaqMan荧光探针，建立了能够同时检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV三种猪冠状病毒和PToV的RT-qPCR方法，该方法的灵敏度可以达到100拷贝/μl。Ma等[12]根据冠状病毒基因组M基因中的保守区域设计引物，建立了基于SYBR Green Ⅰ的RT-qPCR技术，可用于SADS-CoV的检测和流行病学调查，其灵敏度高于基于探针的RT-qPCR和基于凝胶的常规RT-PCR方法。双启动子寡核苷酸(double promoter oligonucleotide, DPO)引物比常规引物特异性更强，可以减少对实验条件的优化以及引物与模板的错配机率。Jia等[13]研制的基于DPO的实时RT-qPCR技术能够实现对PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV进行特异性检测。

近年来，纳米PCR作为一种新型诊断技术得到了快速发展。Zhu等[14]根据PEDV和TGEV的N基因保守区域设计两对引物，建立了能够同时检测PEDV和TGEV的双重纳米PCR检测技术，其检测限分别达到7.6×101和8.5×101拷贝/μl，灵敏度为普通RT-PCR的10倍。Luo等[15]建立了一种基于功能化磁珠富集和特异性纳米扩增技术的超灵敏纳米DNA探针PCR检测方法，其灵敏度可以达到25个拷贝/克样品。可用于PEDV和TGEV的双重检测。以上PCR技术为SECoV的检测提供了有力工具，大大提升了猪场SECoV的防控效率。

1.2 环介导等温扩增技术

2000年，日本学者Notomi开发了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[16]。其基本原理是利用具有较强链置换活性的Bst DNA聚合酶和特殊设计的4条或6条引物，在60～65℃恒温下快速扩增目的基因。Mohamed等[17]开发了一种低成本、快速、半定量的3D打印微流体RT-LAMP芯片检测系统，可同时检测PEDV、PDCoV和TGEV 3种冠状病毒，整个检测过程可以在30min内快速完成，检测结果与qRT-PCR具有很好的一致性。针对新型的猪腹泻冠状病毒SADS-CoV，Wang等[18]根据其病毒N基因的保守序列，建立了准确灵敏的实时RT-LAMP方法，与其他病原无交叉反应，临床样本检测结果与实时RT-PCR方法一致。LAMP检测技术具有快速、简单、灵敏、高通量、精度高等优点，已成为当前临床诊断的热点技术之一。

1.3 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)是一种新型的DNA扩增技术，利用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶的共同作用下，在37℃甚至常温下快速扩增目的基因，与常规PCR相比具有更高的灵敏性，且扩增过程不需要变换温度。Li等[19]根据PEDV和PDCoV的保守区域设计引物成功建立了针对PEDV和PDCoV双重RT-RPA检测方法，灵敏度为100个拷贝/μl。Wang等[20]针对TGEV的S基因设计特异性引物，开发了快速检测TGEV的RT-RPA技术，与其他病原体无交叉反应。Gao等[21]将RPA技术与侧向流免疫层析技术(later flow dipstick,LFD)相结合，建立了LFD-RPA快速检测技术，能够在20 min内检测到PDCoV病毒，其灵敏度是传统PCR的10倍。灵敏度高、特异性强的LFD-RPA技术对设施匮乏地区PDCoV检测具有重要临床应用价值。

1.4 基因芯片技术

基因芯片技术是一种通过杂交测序的原理进行核酸检测的方法。胡靖飞等[22]建立了能够同时检测PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV四种猪肠道病毒的寡核苷酸芯片，该芯片灵敏度高，最低检测限为106拷贝/μl，与PRRSV、PCV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV、PRoV和PDCoV均无交叉反应。马锐等[23]针对PEDV、TGEV和PRoV设计引物，将常规PCR与不对称PCR两种靶基因标记技术应用于可视化芯片，比较两种方法对芯片杂交效率的影响，发现不对称PCR可显著提高猪腹泻病毒可视化共检芯片的杂交效率，为进一步提髙可视化芯片的临床应用提供了重要参考。

2 免疫学检测技术

2.1 中和试验

病毒中和试验(virusneutralization testing)是基于抗原抗体特异性结合原理检测病毒的方法。董志珍等[24]分别采用狗直肠瘤细胞A72和猪肾细胞PK15培养TGEV用于中和试验研究。结果显示，采用A72细胞的中和试验结果好于PK15，且与ELISA检测结果相一致。为了避免目测对实验结果造成的差异，Sigh等[25]开发了一种基于MTT比色法测定PEDV诱导的细胞病变检测方法，该方法适用于病毒中和试验和TCID50的测定，避免了通过目测细胞病变确定抗体滴度的主观性，同时也缩短了实验室检测时间。基于荧光聚焦中和测定(fluorescence focusing neutralization, FFN)的方法已经在PEDV和PDCoV的中和试验中得到应用[26]。Zhang等[27]将PDCoV与热灭活阳性血清在37 ℃孵育1～2 h，将其混合物添加至猪睾丸细胞(ST)或猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞中，通过荧光染色测定其结果，该方法降低了人为因素对细胞病变判断的误差。

2.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是一种较为成熟的实验室血清学检测方法，通过检测抗原或抗体对病毒进行诊断。Luo等[28]基于PDCoV的M蛋白建立了间接ELISA检测方法，该方法具有较好的特异性，不与抗TGEV、PEDV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV等病毒抗体发生交叉反应，能够用于临床样本的检测。S1蛋白是冠状病毒S蛋白的亚单位，与病毒的入侵有关，其抗体能够产生免疫保护，阻止病毒感染。Shan等[29]通过构建PEDV S1基因原核表达质粒，建立了基于S1蛋白的间接ELISA方法(rS1-ELISA)，以IFA作为金标准，结果显示rS1-ELISA具有较高的灵敏度和特异性，为PEDV的抗体检测提供了可靠工具。Zhou等[30,31]利用荧光素酶免疫沉淀系统开发了一种基于SADS-CoV S1蛋白的快速ELISA抗体检测方法，可用于SADS-CoV的早期诊断和再次爆发的流行病学调查。

抗体检测是猪肠道冠状病毒诊断的重要方法，纳米抗体因其特异性强、亲和力高等优势已在医药开发、临床诊断等研究中得到广泛应用[32]。Ma等[33]首次开发出一种带有生物素PEDV纳米抗体的新型阻断ELISA方法，具有灵敏度高、特异性强的特点，可用于PEDV的临床检测。

为了能够在同一样本中区分出不同的病原，Malbec等[34]开发了一种类似固相ELISA的多重免疫分析法，通过将PEDV、TGEV和PDCoV的共同序列S1结构域构建重组蛋白并固定在96孔板，能够在单个样本中同时检测多个不同的病原。该多重免疫分析法是一种有效、可靠的PEDV、TGEV和PDCoV鉴别诊断方法。

2.3 免疫层析技术

在免疫层析检测技术(immunochromatographyassay, ICA)中，胶体金免疫层析技术应用最为广泛，该技术具有快速、简便、特异性强等优点，为基层兽医工作者供了有效的检测手段[35]。李嘉琛等[36]采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，利用两株单克隆抗体成功研制出检测TGEV胶体金试纸条，该试纸特异性好，灵敏度与RT-PCR检测结果一致，优于进口试纸卡。Li等[37]采用纯化后的PEDV重组N蛋白与胶体金结合作为检测线，研制出一种新的胶体金免疫试纸，能够在10 min内检测特异性PEDV抗体，灵敏度和特异性均高于ELISA试剂盒。

近年来，关于PEDV的免疫层析技术发展迅速。Bian等[38]利用细胞表面荧光免疫分析技术(cell surface fluorescence immunoassay, CSFIA)制备了PEDV单克隆抗体(mAbs)，采用胶体金标记的mAb作为检测信号，研制了一种新型的免疫层析方法，可用于猪粪便中PEDV的高灵敏检测。Xu等[39]开发了一种基于铕纳米粒子标记单克隆抗体(EuNPs-mAb)荧光探针的免疫色谱分析方法，与传统荧光试纸相比，使用EuNPs时背景荧光干扰小，灵敏度提高，用于PEDV检测时，检测限可以达到0.218 μg/ml(2.725×103TCID50/mL)。

此外，随着生物技术的不断发展，蛋白质芯片技术在猪病检测方面逐步得到应用[40]。武鑫宇等[41]将PEDV、TGEV、PHEV三种冠状病毒原核表达纯化的N蛋白固定在芯片载体上制备出可视化蛋白芯片，能快速准确的检测以上三种病毒，与ELISA检测结果符合率达90%以上，具有潜在的临床应用价值。

3 展望

SECoV引起的临床症状较为相似，常出现两种或两种以上混合感染情况，而且冠状病毒具有较强的变异性，导致诊断和防控难度加大[42,43]。因此，开发能同时鉴别不同SECoV的多重检测技术，以及适用于基层快速检测标准化规范化的诊断方法对SECoV的防控至关重要。

尽管通过病毒的分离和培养鉴定病原结果可靠，准确性高，但操作周期长，难以在基层推广使用。分子生物学诊断技术需要特殊的实验室环境和专业技术人员操作。免疫层析试纸由于其技术成熟，操作简便快捷，不需要专业技术人员即可完成，非常适合于在基层使用，但在检测灵敏度和定量方面仍需改善。同时，应加大对检测技术的规范性和可重复性的严格把控，以确保检测结果的真实可靠。未来SECoV的检测将朝着更加便捷化、自动化、高通量和低成本方向发展，为SECoV的防控提供更加可靠的技术支撑。