辽东山区产辣蓼中3 种黄酮类成分含量比较研究*

孙 智，张建逵，李佳颖，于 淼，杨燕云

（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

中药辣蓼为蓼科一年生草本植物水蓼（Polygonum hydropiper L.）的全草。具有行滞化湿，散瘀止血，祛风止痒，解毒之功效。用于湿滞内阻，血滞经闭，风湿痹痛，湿疹，风疹，毒蛇咬伤等[1]。辣蓼常作为制作中药神曲的原料使用，也可直接配伍使用，临床多用于治疗囊肿[2]，具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗氧化[5]和驱杀虫[6]作用。辣蓼在我国广泛分布，并在湖南、广西、贵州等南方省份得到广泛应用，并在辽宁，其药用情况仅见于《辽宁中药志》[7]。在《辽宁省中药材标准》[8]中，收载了辣蓼药材的标准。但在其鉴别项下，只记载了显微鉴定和槲皮素的薄层色谱鉴定方法。没有含量测定的要求。在第四次全国中药资源普查工作中发现，辽东山区辣蓼资源丰富，但并没有得到充分的开发和利用。其质量如何，至今也鲜有报道。现代研究表明，辣蓼的有效成分为黄酮类化合物[9]，槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷等为辣蓼含量较高的重要成分[10-12]。因此，本实验采用HPLC 法，对辽东山区不同产地的辣蓼中金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素3 种黄酮类成分含量进行测定和比较，为辣蓼药材的质量研究及资源开发利用提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及试药

1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；包括G7115A 型VWD 检测器，G7129A 型四元泵；TD 型电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）；JD60-4 型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；CP225D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ5200DB 型数控超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）；FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

乙腈、甲醇均为色谱纯，默克公司；甲醇、H3PO4均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；金丝桃苷对照品（批号：Y01D7X25998 上海源叶生物科技有限公司）；槲皮苷对照品（批号：P01M8F30364 上海源叶生物科技有限公司）；槲皮素对照品（批号：C20J6Y1722 上海源叶生物科技有限公司）。

2018~2020 年，每年8 月均从辽东山区不同产地采集辣蓼药材，共11 批。均经辽宁中医药大学药学院张建逵副教授鉴定为蓼科植物水蓼（Polygonum hydropiper L.）的全草；具体来源见表1。所有样品均粉碎后，过40 目筛备用。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

Waters symmetry-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以甲醇（A）-乙腈（B）-0.3% H3PO4水溶液（C）为流动相。洗脱程序见表2。检测波长为360nm，流速为 1.0mL·min-1，柱温为 30℃，进样量 10μL。在此条件下供试品中金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素均能达到很好的分离。结果见图1。

表2 梯度洗脱表Tab.2 Gradient elution table

图1 HPLC 图谱Fig.1 HPLC chromatograms

1.2.2 对照品溶液的制备 取金丝桃苷对照品、槲皮苷对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加纯甲醇制成每 1mL 含 25.0μg 金丝桃苷、19.0μg 槲皮苷、67.0μg 槲皮素的混合溶液，即得。

1.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯甲醇25mL，密塞，称定重量，超声50min，超声温度50℃，放冷，再称定重量，用纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

精密称定0.40mg 金丝桃苷对照品, 1.80mg 槲皮苷对照品，0.20mg 槲皮素对照品，置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，即为对照品溶液，待用。分别精密吸取 3、5、10μL，注入液相色谱仪，测定。精密吸取1mL 对照品溶液，置于10mL 容量瓶中，用甲醇定容，进行测定。以色谱峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程为：金丝桃苷Y=27.3953X+3.6637，r=0.9998；槲皮苷 Y=24.6683X-8.7419，r=0.9998；槲皮素 Y=27.6316X+3.3116，r=0.9999。结果表明，金丝桃苷含量在 4.1～41.0μg·mL-1，槲皮苷含量在 7.0～176.0μg·mL-1，槲皮素含量在2.4～27.0μg·mL-1范围内具良好的线性关系。

2.2 重现性实验

精密称取S9样品粉末2.0g，按“1.2.3”项下方法制备成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，平行进样5 次。结果辣蓼中金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素RSD 分别为1.42%、1.84%、2.33%，表明此方法重现性良好。

2.3 稳定性实验

精密称取S9样品粉末2.0g，按“1.2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别于 0、2、4、6h 进样测定，测得金丝桃苷的RSD 值为2.50%，槲皮苷RSD 值为2.65%，槲皮素RSD 值为2.48%，表明供试品溶液在6h 内稳定。

2.4 重复性实验

精密称取S9样品粉末5 份，每份1.0g，分别按“1.2.3”项下方法制备成供试品溶液，测定峰面积，测得金丝桃苷RSD 值为1.79%，槲皮苷RSD 值为2.90%，槲皮素RSD 值为2.85%。表明此方法重复性良好。

2.5 加样回收率实验

精密称取已知成分含量的S9样品粉末6 份，每份1.0g（金丝桃苷平均含量为0. 2830mg·g-1，槲皮苷平均含量为 0.3261mg·g-1，槲皮素平均含量为0.1547mg·g-1），按“1.2.3”项下方法制备成供试品溶液，并精密加入浓度为10.8μg·mL-1的金丝桃苷，9.3μg·mL-1的槲皮苷，8.7μg·mL-1的槲皮素标准品混合溶液30mL，在“1.2.1”项色谱条件下测定，计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收率试验结果Tab.3 Result of recovery tests

由表3 结果可见，测得平均回收率和RSD 值分别为：金丝桃苷99.9%、2.5%；槲皮苷102.2%、2.2%；槲皮素101.7%、2.0%。表明回收率良好。

2.6 样品含量测定与数据分析

将11 批样品按“1.2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别进样测定并计算金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n=3）Tab.4 Result of sample content determination

由表4 可知，测得辽东山区不同产地（S1~S1）1辣蓼药材中金丝桃苷含量在0.0576～0.4706mg·g-1之间；槲皮苷含量在0.2742～1.9319mg·g-1之间；槲皮素含量在 0.0341～0.1655mg·g-1之间。其中，S11金丝桃苷含量最高，与最低相差8.17 倍；S1槲皮苷含量高，与最低相差7.05 倍；S4槲皮素含量最高，与最低相差4.85 倍。结果表明，辽东山区辣蓼药材质量不均一，金丝桃苷含量差异最为显著，其中S10辣蓼中金丝桃苷、槲皮苷含量最少。

为了与其他地区的辣蓼药材3 种黄酮类成分含量进行比较，将文献[12-17]中广东省、广西省、海南省、贵州省等南方省区的数据与本实验数据分别进行聚类分析，结果表明，辽东山区的11 批样品均与南方省区的样品相交错，不能单独聚为一类，因此，需要进一步的统计分析。将文献[12-17]中南方省区的数据并为一类，各成分含量数据分别与本实验测得数据进行正态性检验，结果表明，各地区金丝桃苷含量均呈正态分布（P＞0.05），各地区槲皮苷与槲皮素含量均不呈正态分布（P＜0.05）。因此，对于各地区金丝桃苷含量数据采用两独立样本t 检验，对各地区槲皮苷与槲皮素含量数据采用Mann-Whitney U检验，结果为：辽东山区与其他地区辣蓼药材在金丝桃苷与槲皮苷的含量上无显著性差异（P＞0.05），但在槲皮素含量上，辽东山区产辣蓼药材极显著低于南方省份产辣蓼（P＜0.01）。辽东山区产辣蓼药材中3 种黄酮类成分平均含量均低于南方省份产辣蓼。因此，可以认为辽东山区辣蓼药材质量与文献[11-16]中产自广东省、广西省、海南省、贵州省等南方省区的辣蓼质量有所不同。

3 结论

本实验的采样范围，从最南端的庄河市到最北端的西丰县，涵盖了辽东山区的大部分区域，采样具有一定的代表性。文献[11-16]的采样地点包括广东、广西、海南、贵州、云南等省的多个地区，范围较广。所以二者的比较具有一定意义。部分文献[10-12，16]报道了各地辣蓼药材中芦丁的含量，本实验也曾对芦丁含量进行测定，结果发现，所有样品中芦丁含量极低或未检出，因此，未将该成分的检测结果列出。所以从总体而言，辽东山区产辣蓼药材槲皮素和芦丁成分含量较南方各省产辣蓼低。且李明等对16 个产地辣蓼药材的质量研究结果表明，南方产辣蓼中芦丁和槲皮素两种成分含量均比北方产辣蓼高[16]。本研究结果与此基本一致。这可能与各地环境差异及种质不同有关，可认为是一种与南方省区所产辣蓼不同的化学生态型。有文献报道了位于辽西的锦州市、辽南的大连市产辣蓼药材中芦丁和槲皮素含量也与辽东山区产辣蓼不同[16]，这也可能与辽东山区产辣蓼不是一种化学生态型有关，有待于进一步深入研究。

在第四次全国中药资源普查工作中发现，辽东山区辣蓼资源丰富，但缺乏充分的开发和利用。本研究建立了辣蓼中3 种黄酮类成分的含量测定方法，并通过对辽东山区产辣蓼中上述成分的比较，为辣蓼药材质量标准、种质资源评价及资源的开发利用提供科学依据。