红细胞冷冻保存的历史、机理与研究进展

沈凌霄 赵刚

1 前言 1949年，Pogle、Smith 和Parkes在Nature上报道他们在一次实验中偶然发现了添加5%的甘油后人类精子的冷冻存活率能明显提高的现象，在随后关于鸡的精子冻存实验中他们使用40%的甘油在-79℃冷冻保存20分钟后快速复温，再次发现精子几乎全部存活并且完整地保留了冻前移动能力，从此现代低温生物学的大门正式开启[1]。红细胞作为人体内数量最多的生物细胞，自然也成为生物低温保存领域中经典的研究对象之一。冷冻红细胞最重要的意义就是尽可能地延长了保存时间，虽然现有基于抗凝剂和营养液的2～6℃红细胞体外储存方案可以将储存期限延长至5～7周，比如MAP可以保存红细胞35天，SAGM、AS-1、AS-3和AS-5可以保存红细胞42天，PAGGS-S/M和Erythro-Sol可以保存红细胞49天等[2-4]，但在面临稀有血型、不规则抗体、战争、自然灾害等情况时，仅1个多月的保存时间仍然满足不了实际需要[5-8]。此外，体外冷藏红细胞还会面临储存损伤（Storage lesion）的风险，比如ATP和2，3-DPG的丢失，蛋白质、脂质和碳水化合物遭受氧化损伤，细胞形态改变和膜丢失，粘度增加，变形能力减弱，携氧能力降低等[9]。因此，为了保证输注人体内的红细胞仍能维持较好的状态和一定的氧气输送功能，储存时间过长的红细胞不建议用于临床输血[10]。红细胞在深低温或超低温（-80℃或-196℃）下将处于冻结状态，其生理代谢和化学反应几乎完全停止，因此相比4℃冷藏保存，低温冷冻储存的红细胞，其血红蛋白结构、细胞膜状态以及胞内能量物质都不再受到储存时间的影响，实现了真正意义上的长期保存[11]。1987年9月，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了-80℃条件下甘油化红细胞可以冷冻保存10年，Valeri等人也报道了经过21年、37年冷冻保存后的甘油化红细胞在完成复温洗涤处理后仍然符合临床使用标准[12,13]。从大规模输血患者的临床表现来看，即使出现一些输血反应，比如凝血功能受损、肾功能衰竭、深静脉血栓形成或呼吸衰竭等并发症，也没有证据表明是由于输注冷冻红细胞造成的[14]。本综述将回顾红细胞冷冻保存历史，探讨红细胞低温损伤机理，总结红细胞冷冻最新科研成果，为耕耘在输血医学领域的医务人员以及关注红细胞冷冻保存的科研工作者提供一些低温保存方面的科学知识。

2 红细胞低温保存历史回顾

2.1 红细胞低温保存的前期探索：红细胞冷冻保存的历史要追溯到1949年，一个理想主义者Luyet曾致力于使用无任何低温保护剂的超快速玻璃化冷冻的方法让红细胞存活，虽然他使用极薄的薄膜在几毫秒内从0℃快速降温到-50℃后成功回收了75%的公牛红细胞，但由于冻存体积仅为0.1 mL，实际意义尚不明显，可他却是世界上公认的红细胞冷冻先驱[15,16]。同样在1949年，在一次血液领域的会议上，Luyet、Strumia、Griffitts、Walter和Gibson等人相继报道了红细胞冷冻的早期经验[17-21]。1950年，作为成功发现甘油可以冷冻精子的小组成员之一，Smith在The Lancet首次报道了使用终浓度15%甘油并在-79℃干冰乙醇浴中冷冻的方案，发现冷冻8周后复温的红细胞只有轻微溶血[22]。1951年，Sloviter在The Lancet上首次报道了用透析的方法来对冻后红细胞进行去甘油操作，从而解决了含甘油的红细胞直接加入血浆或者等渗溶液中迅速溶血的问题[23]。同样在1951年，Mollison等人也在The Lancet上报道了第一例向人输注经甘油冷冻过的红细胞的案例，并和未冷冻组对比了输注后红细胞人体内存活率，发现无显著差异[24]。至此，人类冷冻红细胞的时代正式拉开帷幕，使用15%甘油并在-79℃干冰乙醇浴中冷冻成为早期较为通用的红细胞冷冻方法[25]，随后更多的关于甘油保存红细胞优化方案以及非甘油保存方案逐渐被提出。

1952年，Lovelock等人在The Lancet上提出了可以先用非渗透性的0.33 M柠檬酸钠或者1 M葡萄糖再用生理盐水的梯度洗涤甘油的方法来解决透析法去甘油费时费力的问题，这是梯度洗涤甘油方法的雏形[26]。同样在1952年，Sloviter在Nature上报道了在-79℃下15%甘油可以冷冻保存红细胞长达9个月[27]。1953年，Chaplin等人在The Lancet上连发两文，先报道了可以将甘油浓度提升到30%终浓度并证明能在-20℃下储存3个月以上几乎无溶血，后报道了使用Buckley等人开发的长程离心机再加能引入洗涤液的烧瓶，从而完成对红细胞连续洗涤甘油的工作，将洗涤时间缩短到2.5 h（如果洗涤500 mL红细胞采用Sloviter透析方法需48 h，采用Lovelock手工梯度离心洗涤需5～6 h），这种方法原理上与最终的Haemonetics系统相似[28-30]。1955年，Meryman等人报道了可以用含6%葡萄糖的全血，在液氮中以液滴形式快速冷冻后能获得90%以上的冷冻存活率，80%以上的24 h体内存活率，这是红细胞首次在-196℃液氮冷冻的报道[31]。1959年，Lovelock等人在Nature上报道了除甘油之外，15% DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）同样可以在-79℃干冰乙醇浴下实现红细胞的冷冻保存，同时也解决了对甘油渗透性差的牛红细胞冷冻存活率过低的问题[32]。1950s～1960s年期间还出现了一些经典的非渗透性保护剂保存方案，比如Strumia的乳糖&葡萄糖干冰乙醇浴方案，Rinfret的PVP（Polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）-白蛋白-液氮冷冻方案。

1958年，Strumia等人在Science上报道了可以单独或组合使用乳糖（Lactose）和葡萄糖（Dextrose）（比如15%乳糖-10%葡萄糖）并使用25～50 mL扁平容器在-93℃干冰乙醇浴中冷冻后获得95%的冷冻存活率，复温去上清后未经洗涤直接输注人体[33]，并在随后几年进一步研究了乳糖和葡萄糖冷冻保存红细胞的机理[34-36]。不过1964年，Pert等人应美国红十字会的要求在对比乳糖&葡萄糖、PVP和甘油液氮冷冻红细胞效果的实验中，发现乳糖对动物产生毒性，随后Rinfret等人便建议放弃推广乳糖&葡萄糖方案[37,38]。1965年，Strumia等人还深入研究了一个之前偶然发现的有意思的现象，即如果提前使用5%～15%的乳糖先孵育5 min红细胞后离心去上清，再添加24%白蛋白或者20% Dextran（葡聚糖，MW 40 kDa）在-73℃干冰乙醇浴中冷冻，最后可获得98%以上的冷冻存活率，60%～70%的24 h体内存活率。可是如果跳过乳糖预孵育步骤，虽然最后冷冻存活率也很高，但24 h体内存活率会迅速降低到仅剩20%～40%[39,40]。

1955年，Bricka等人首次报道了PVP和Dextran在红细胞冷冻保存中的应用，后续也有一些人跟进但还处于摸索阶段[41-43]。1960～1962年，Rinfret等人意识到冷冻和复温过程中传热速率的重要性，开始有针对性地设计了能够在液氮中快速传热的300 mL波浪纹理铝盒，并用该铝盒证明了PVP液氮冷冻方案相比乳糖&葡萄糖-78℃干冰乙醇方案有更好的保存效果[44,45]。1964年，Rinfret等人又从避免使用任何渗透性溶质（如甘油、DMSO和葡萄糖等）的角度出发，专门针对PVP设计了多种适用于临床的红细胞液氮冷冻保存的程序[46]。1965年，Rinfret等人还在保护剂中增加了白蛋白并降低了PVP浓度，最终PVP（14%）-白蛋白（3%）-液氮冷冻保存方案可获得97%的冷冻存活率，复温后允许直接输注，但会出现10%～20%血管内溶血的情况[17,38,47]。1968年，Krijnen等人重新评估了Rinfret的PVP-白蛋白-液氮冷冻方案[48]，虽然冷冻保存后的红细胞胞内包括ATP、乳酸、糖酵解酶、细胞膜脆性等多种指标结果良好，但考虑到PVP在洗涤过程中偶尔会造成过高浓度的游离血红蛋白，以及已被证明无法在人体内代谢干净（比如在网状内皮系统），仍然推荐使用低浓度甘油结合液氮方法来冷冻保存红细胞[25,49,50]。

其它非渗透性保护剂例如PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）、Dextran、HES（Hydroxyethyl starch，羟乙基淀粉）等在早年也有诸多进展到临床实验的报道。1962年，Sloviter等人在Nature报道了终浓度20%的PEG（MW 635 Da）在-79℃干冰乙醇浴中冷冻并使用10%蔗糖梯度洗涤的方案，不过冷冻洗涤回收率会受到红细胞储存天数的影响，但输入人体内红细胞存活率普遍大于70%[51,52]。1965年，Verdier在研究使用终浓度15%的Dextran（MW 20 kDa）装在12 mL铝箔袋放入液氮中冷冻时，发现使用肝素抗凝替代ACD抗凝后，相比Pert的PVP[37]、Strumia的乳糖&葡萄糖[34]冷冻存活率会更高[53]。1967年，Knorpp等人在Science上报道了使用终浓度15%的HES（MW 450 kDa）液氮冷冻方案，得到97%的冷冻存活率，并认为HES相比PVP的优点在于更有助患者体内代谢，从而免去复温后的洗涤处理[54]。

虽然临床上本身就允许一些非渗透性保护剂在患者极度失血的情况下作为血容量替代物直接应急输入人体，比如PVP、Dextran、HES等[11]，但它们在红细胞冷冻保存的应用中仍存在一些质疑。1976年，Allen等人通过液氮冷冻了400 mL压积40%终浓度14% HES的红细胞悬液，虽然也得到了97%的冷冻存活率以及大于80%的盐水稳定率（有关体外模拟血管内溶血的实验），但通过电子显微镜观察后发现HES本身就会对红细胞膜造成轻微的损伤（可能会自愈），然而这种膜损伤会在冷冻后进一步加大并不可逆转，最终导致钾离子丢失，而且受损的红细胞也会释放出部分游离血红蛋白干扰冷冻后存活率的测量[55]。1978年，Allen等人在进一步研究不同洗涤液洗涤经14% HES冷冻过的红细胞时发现受损细胞表面会有胞内物质粘附，最终洗涤重悬后产生的血影细胞（Ghost cell）占总细胞数量的12%～14%，证明了之前其实是误导性的过高冷冻存活率[56]。1983年，Williams等人认为诸如PVP、Dextran、HES等浓缩聚合物会使细胞表面溶液的表面活性高于血红蛋白，从而改变了细胞边界处的界面能，形成血红蛋白不易穿过的表界面，并掩盖了膜缺陷，这种“创可贴效应”会随着输血后聚合物被稀释而消失，因此成功解释了输注聚合物冷冻过的红细胞后发生血管内溶血的问题[57]。虽然Lionetti等人[58,59]、Thomas等人[60,61]、尤其是Sputtek等人[62-68]都通过使用HES冷冻红细胞得到了很好的结果，甚至完成了输注人体的临床实验（比如Sputtek成功报道了经11.5%HES液氮冷冻过的红细胞无需洗涤即可直接输回人体，冷冻复温后的红细胞盐水稳定率可达92%，输回人体24 h后血浆中85%的HES可在体内自行代谢消除），但最后还是发现了输血后血浆中血红蛋白浓度明显升高的情况并仍面临肾毒性的风险[68]。因此，直到目前为止如何有效预防由非渗透性保护剂带来的膜损伤和随后出现的血管内溶血的问题仍具有一定的挑战性（可能添加血浆和血清蛋白会有用），而且这个问题在红细胞冻干过程中的干燥和补液环节中也同样存在[17]。

2.2 红细胞低温保存的临床应用：通常红细胞冷冻的方法可以分为三类：（1）使用中等浓度甘油（2～3 M）的中速冷冻；（2）使用高浓度甘油（4～5 M）的慢速冷冻；（3）使用非渗透性保护剂的快速冷冻[69]。使用非渗透性保护剂快速冷冻的设计目标是能够获得保护剂和游离血红蛋白浓度都足够低的细胞悬浮液，从而可以无需洗涤直接输入人体[69]。但从安全性角度出发，人们已经禁止了这种连同保护剂和过高的游离血红蛋白输入人体的方案，所以临床推广冷冻红细胞应用方案的重点就放在如何去除高浓度甘油的方法研究上[69,70]。回顾过去临床上曾建立起三种不同的方法用于冷冻保存红细胞，也就是众人熟知的“团聚沉降法”、“低甘油快冻法”、“高甘油慢冻法”[8,71]。但在这三种方法之前Cohn ADL离心机的出现则是冷冻红细胞走向临床应用的里程碑[72]。

1951年，Cohn等人提出如果想在临床上大量使用冷冻红细胞，就需要一个封闭自动化的设备来解决手工去甘油过程中出现的操作过于繁琐、无法保证无菌环境等问题[73]。1954年，Tullis等人报道了使用Arthur D.Little公司开发的基于Cohn血浆分离白蛋白程序的自动化离心设备来专门去除甘油，整个系统被命名为Cohn ADL离心机（也叫Cohn分馏器）[74-76]。1956年，Tullis等人在Science上详细介绍了这种由两个离心碗组成的Cohn ADL离心机的工作原理，并在随后几年陆续开展研究，比如在-80℃或-120℃冰箱以终浓度50%甘油保存红细胞19个月后无异样，冷冻洗涤回收率达80%以上，以及能在45～50 min内完成添加甘油操作和在90～120 min内完成去甘油操作等[77-80]。1960年前后，由于Cohn ADL离心机甘油冷冻技术的发展，迅速推动了现代血站的建立，如Haynes等人在美国海军医院应用该技术完成了向患者输注超过1 014个单位的冷冻红细胞，其中最长的红细胞冷冻时间为44个月[81-83]。不过由于其耗材成本高、仪器操作流程复杂、添加/去除甘油耗时较长等问题，该方法逐渐被抛弃[84]。1967年，Tullis报道了他和来自ADL公司的工程师Allan Latham（也称为Jack）改进后的可以实现血液成分分离、添加/去除甘油的离心碗，即著名的Latham离心碗[85,86]。1971年，Latham成立了美国血液技术公司Haemonetics，直至今天该公司仍以不断创新的产品推动着全球输血行业的进步。

“团聚沉降法”由Huggins于1963年在Science上首次报道[87-89]。该方法先向浓缩红细胞添加等体积含8%葡萄糖的8.6 M ECA溶液（ECA，Endocellular cryophylactic agents，最先使用的是DMSO，后来也用甘油或丙二醇替代）得到ECA终浓度为5.5 M的红细胞悬液[90,91]，放在-85℃～-95℃冰箱冷冻，复温后的洗涤是利用当pH在5.2～6.1之间同时电解质浓度低于0.02 M，血浆中的γ-球蛋白（也就是免疫球蛋白）会和红细胞膜脂蛋白结合从而形成可逆可沉降的红细胞团聚体的原理，具体步骤是用10%葡萄糖溶液以1:8的比例稀释红细胞悬液并触发团聚沉降条件，去除上清后再用pH大于6.7的等渗电解质溶液重悬从而完成洗涤[92,93]。该方法最大优势是可以免去离心机的使用，一个5站式细胞凝集器每小时可处理15个单位的冷冻红细胞[91,94]。不过由于回收率较低（75%～85%）、溶液中需确保γ-球蛋白的存在、胞内钾离子容易流失等问题，仅在1960年代广泛使用[91,95]。1970年代，Sumida在日本引入了这种方法，并一直在评估该方法下红细胞长期储存（超过30年）的稳定性[96,97]。

“低甘油快冻法”最先源于1962年Pert在墨西哥城举办的国际会议上报道，可以使用低浓度甘油通过液氮快速冷冻的方式来提高红细胞的冷冻回收率[37,98-101]。1964年，Krijnen等人综合了Pert的低甘油快冻法的同时引入Cohen等人为去除冷冻血小板中的甘油而添加可以减缓渗透伤害的非渗透性山梨糖醇，并使用不锈钢的扁平容器成功冻存1个单位的红细胞，还提出可以使用特氟龙袋结合离心机的方法来缩短输血前去甘油的时间[102,103]，并在随后几年陆续报道了该方法的一些研究结果[25,101,104]。1968年，Rowe等人在Krijnen基础上用甘露醇替代了山梨糖醇，并通过超过350例临床输注实验证明了低甘油快冻法的安全性[105]。具体的Rowe方法是通过ACD采集500 mL全血后离心得到250 mL浓缩红细胞，再等体积添加250 mL甘油保护剂溶液（其中甘油浓度用的是28% v/v，转换成w/v约等于35%），均匀混合后甘油最终浓度为17.5%。随后灌入容积约600 mL不锈钢的扁平容器，直接放进液氮中冷冻，2～3 min后存入液氮中。复温使用42～45℃水浴快速复温，完成后先离心再使用16%甘露醇（1次）-0.9% NaCl（2次）梯度洗涤方案洗涤，共消耗不到1 L洗涤液。最终该方法冷冻存活率达到97.3%，冷冻洗涤回收率达到95.7%[105]。

“高甘油慢冻法”最先源于Tullis的50%甘油Cohn ADL离心法[79,83]以及Huggins的5.5 M ECA团聚法[90,91]（如果ECA选用甘油，5.5 M刚好也是50%），该两种方法都使用了大于或者近似45%浓度的甘油或者DMSO，并且直接放在-80℃左右的冰箱里而不是干冰乙醇浴里来进行慢速冷冻（当甘油浓度达到40%～50%后就无需快速降温或者控制降温速度）[81,105,106]。1970年，Tuills等人证实了高甘油下的红细胞在-80℃冷冻可以保存10年[107]。1972年，Meryman和Hornblower正式提出最经典的高甘油慢冻法[84]，他们使用6.2 M甘油溶液并分两步添加得到终浓度约35%的甘油化红细胞悬液，放入-85℃冰箱慢速冷冻后再用37℃水浴复温。洗涤过程为了改善高浓度甘油离心沉降特性差的问题，同时减小洗涤前初始渗透压差，他们使用12%（1次）-1.6% NaCl（1次）高渗盐溶液代替前人的甘露醇或者乳酸钠溶液进行分步预稀释，从而改变细胞密度促进沉降，然后再利用ADL-Latham细胞洗涤系统按照1.6%（1次）-0.8%NaCl（1次，含2%葡萄糖）梯度洗涤方案洗涤，共消耗3 L多洗涤液，他们还从渗透极限的角度解释了盐溶液浓度选择的理由。最终该方法冷冻存活率99.5%，冷冻洗涤回收率98.0%[69,84,108]。

1975年，来自美国海军血液研究实验室的Valeri进一步优化了“低甘油快冻法”和“高甘油慢冻法”，并首次提出了可以将红细胞复兴液（也是由Valeri等人发明，并在1972年NEJM上报道，主要由丙酮酸、肌苷、葡萄糖、磷酸盐和腺嘌呤等成分组成[109]）和冷冻保存相耦合的建议，还强调了甘油化前需要将红细胞浓缩至90%的压积（输入人体内也需浓缩至90%），最终得到人们广为熟知的40%高甘油和20%低甘油的两个浓度[110]。具体来说，Valeri使用一步法将35%的甘油试剂制备成20%的甘油化红细胞并使用液氮冷冻，然后在-150℃液氮蒸汽下储存再用42℃水浴复温，或者用两步法将57%（6.2 M）的甘油保护剂制备成40%的甘油化红细胞，然后在-80℃冰箱下冷冻储存再用37℃水浴复温。洗涤过程使用三种市售血液洗涤机，并强调了洗涤前先加入高渗溶液进行平衡的重要性，但会因仪器不同选择一步稀释或者两步稀释，最后40%高甘油使用12%（稀释）-1.6%（稀释、洗涤）-0.9%（洗涤）NaCl梯度洗涤方案，耗费2.2～3.2 L洗涤液，20%低甘油使用3.2%（稀释、洗涤）-0.9%（洗涤）NaCl梯度洗涤方案，耗费1.5～2.5 L洗涤液。上述所有方案红细胞冷冻洗涤回收率都在90%以上，各项指标诸如离子浓度、乳酸、ATP、2，3-DPG、嘌呤代谢、P50氧分压等指标无显著差异，但发现低甘油方案在洗涤后储存24 h溶血率方面比高甘油方案要略高[110]，类似的结论别人也曾报道过[111]。不过也有人发现在-196℃冷冻的红细胞的渗透脆性曲线大多在正常范围内，而在-65℃～-80℃冷冻的红细胞则会偏离正常范围[112]。1976年，Meryman和Hornblower还针对镰状红细胞调整了标准的去甘油化操作，避免洗涤过程出现过高的溶血[113]。

目前低甘油快冻普遍在欧洲使用，高甘油慢冻普遍在美国和加拿大使用[8]。我国以高甘油慢冻为主，因为高甘油慢冻不需要特殊的冷冻或者解冻的设备，也无需金属容器或者特制塑料，可以放在干冰中进行长距离运输（40%甘油化红细胞可以承受-20℃～-85℃温度波动，这一点相对20%甘油液氮气相存储优势尤为明显[114,115]），但缺点是难以保证在不损失过量红细胞的前提下又能在合理的时间以合理的成本添加和去除高浓度甘油[84]。低甘油快冻的主要优势就是操作简单、多功能性以及具有一定适应变化的能力[116]。不管低甘油快冻还是高甘油慢冻，采血后6天内需要完成甘油化冷冻操作（文献中建议10天以内，最好5～6天，在此时间段可以维持最佳的红细胞ATP、2，3-DPG、Na+、K+等代谢水平[117,118]），可以确定的是该两种方法冷冻洗涤后的红细胞质量均符合美国血库协会AABB制定的输血安全标准，即去甘油化后的红细胞回收率达到80%以上，输血后24 h体内存活率75%以上[114]。通常医务人员手工解冻去甘油时，由于处于开放系统，存在细菌污染的可能，因此美国FDA规定去甘油化的红细胞需要在24 h内输入人体，但如果用封闭耗材配合机器自动化去除则可以延长至2周[114]。2001年，美国血液技术公司联合美国海军血液研究实验室研发的专门用于红细胞添加/去除甘油的自动化仪器ACP-215上市，该系统配套无菌连接器和耗材（内有外部密封的一次性聚碳酸酯离心碗，内联0.22 μm过滤器），并装有一套光学系统监测去甘油化时废液中游离血红蛋白浓度来确保红细胞质量[119]。同样在2001年，Valeri等人对ACP 215添加和去除甘油后的红细胞质量做了全面的研究，认为经过ACP 215洗涤过的红细胞在4℃下AS-3保存液中可以延长保存至15天，输血后24 h体内存活率77±9%，1个单位的红细胞冷冻洗涤回收率87±5%（国外血站采1个单位全血通常按照450-500 mL计算[7,14,114]，其中ACP 215的275 mL离心碗最大洗涤纯红细胞的量为180 mL）[120]。虽然ACP 215是按照高甘油慢冻法研发的，但它同样可以处理低甘油快冻法冷冻的红细胞[111]，只不过由于冻存装置是铝盒，因此无法无菌连接，解冻去甘油后的储存时间仍然是24 h。但是考虑到从冰箱取出后再复温洗涤，通常要耗时2 h（1个单位的冷冻红细胞在42℃水浴融化需要45 min，ACP 215洗涤1个单位红细胞需要55～57 min，以及其它一些表格文书的准备[14,94,121,122]），加上血站实际使用ACP 215操作时洗涤回收率偶尔只有75%，因此在面对一些紧急情况下的应急输血挑战时，简化去甘油流程、缩短洗涤时间等仍具有重要研究意义。

3 红细胞低温保存机理 生物细胞在低温下代谢会减缓，甚至停止，尤其在-150℃以下，几乎所有的生物学行为或者物理化学变化都将不再进行[123]。令人惊讶的是，细胞本身是能够承受住深低温的环境并能长久存活，而真正的低温损伤主要来源于添加和去除保护剂过程中的渗透损伤，冷冻过程中的溶液损伤和胞内冰损伤，复温过程中的重结晶损伤等[124]。而决定细胞保存成功因素，主要取决于保护剂的浓度和种类、降温和复温的速率、细胞的浓度、储存的温度、保护剂的添加以及复温后去除的方法等[6,125,126]。

3.1 保护剂引起的渗透性变化：成熟的红细胞无细胞核和细胞器，形态呈双凹盘状，直径6～8 μm，厚度1.5～2.5 μm，体积80～100 fL，生命周期120天，胞内有大量的负责运输氧气的血红蛋白，其比例占红细胞干重的95%[11,127]。双凹型的结构使得红细胞表面积与体积之比较大，利于氧气的吸收和运输，也利于红细胞形变从而能够通过狭窄的毛细血管（最窄2～3 μm）[128]。但人们容易忽略的是，红细胞膜上存在大量的专门负责红细胞跨膜水输运的水通道蛋白，因此红细胞相比其它细胞对水具有更高的渗透性[129]。1992年，Agre等人在Science上报道了将红细胞膜上的水通道蛋白通过体外转录的方式注入非洲爪蟾卵母细胞后，放入低渗溶液中细胞体积会立刻增大的现象，从而证明了红细胞膜上存在专门的通道使得水可以快速进入红细胞[130]。在低温生物学里的跨膜输运模型中有专门描述细胞膜对水渗透性的参数Lp（Hydraulic conductivity），人成熟红细胞的Lp在8.19～23.8 μm/min/atm[131]，人MII期（MetaphaseⅡ，中期Ⅱ）成熟卵母细胞的Lp在0.24～1.25 μm/min/atm[132]，前者明显大于后者一个数量级。虽然甘油也能渗透进红细胞，但是红细胞对水的渗透性是甘油的3 000倍，此外细胞膜一般对NaCl是不可渗透的[133-135]。从水和甘油穿过红细胞膜的时间尺度上看，水穿过红细胞膜是毫秒级，而甘油则需要几秒（时间长短会受到环境温度和pH值影响），因此添加或者去除甘油时，一旦悬浮液中甘油浓度发生变化，瞬时的渗透压对细胞体积的影响是可以预见的[84]。

关于由保护剂引起的细胞渗透性变化过程，这里以甘油举例说明。在向等渗红细胞悬液添加甘油时，由于胞外渗透压瞬间增高，为了保持胞内外化学势平衡，跨膜输运能力更强的水会先从胞内跑到胞外，细胞内水分减少，细胞体积变小，电解质浓度增加。此时胞内是超高渗电解质，胞外是高渗甘油和等渗电解质，达到初步平衡。但由于甘油是渗透性的，对于甘油来说其胞内外化学势并没有达到平衡，因此甘油会逐渐进入细胞，细胞体积逐渐恢复，电解质浓度逐渐降低。当细胞体积恢复为原体积时，细胞内电解质恢复等渗，胞内甘油浓度和胞外浓度相等，化学势最终达到平衡。如果胞外存在非渗透性保护剂，细胞内水将同样跑到胞外，细胞体积收缩，但不会再恢复到原来的体积，因为只有这样浓度不断提高的胞内电解质的渗透压才会达到和胞外非渗透性保护剂外加等渗电解质的渗透压相同的程度。换言之，胞外非渗透性溶质决定了细胞的最终体积（其实严格意义上说，细胞内甘油所占的体积也对细胞最终体积有很小的贡献[134]）。去除保护剂的过程本质上也是化学势平衡的过程，体积变化方面和添加过程相反，先膨胀后收缩，期间伴随着水先进入后离开的过程[136]。

不管细胞收缩还是膨胀都有其耐受极限，超过该极限细胞就会受到不可逆转的伤害。对红细胞来说，其可承受的渗透极限是等渗的0.5～0.75倍到4～5倍[84,134,135,137]，也有报道说红细胞最大可承受胞外渗透压范围在1 800～2 000 mOsm/kg，否则会发生阳离子泄漏[138-140]。渗透损伤在去除保护剂过程中会比在添加保护剂时更严重，因为水进入细胞导致的细胞膨胀比水流出细胞导致的细胞收缩更敏感[141]。通常可以使用多步梯度添加/去除保护剂的方法降低渗透损伤，使得细胞体积远离体积极限[142]。比如1972年，Meryman报道的“高甘油慢冻法”中第1次稀释液之所以选择150 mL的12%的NaCl溶液，一方面是因为12%的NaCl溶液渗透压刚好是甘油化红细胞悬液渗透压（约25倍等渗）的0.5倍，从而确保细胞体积不过度膨胀，另一方面选择150 mL添加到650 mL的甘油化红细胞悬液，是因为混合后其非渗透性溶质（NaCl为不可渗透）为等渗的3.5倍，从而确保细胞体积不过分收缩，此外还相对减小了下一次稀释的初始体积，提高了细胞对低渗溶液的耐受性[84]。

3.2 冷冻过程中的低温损伤：最早人们将冷冻红细胞导致的溶血归因于尖锐的冰晶对红细胞膜的机械破坏，显然这也是人们最容易联想到的[18,143,144]。1953年，Lovelock认为冷冻过程中溶液形成的冰晶本身对红细胞并无伤害，他观察到不管甘油浓度或者冷冻温度如何变化，只要胞内外电解质浓度超过0.8 M就会发现溶血现象，这和将细胞悬浮在大于0.8 M NaCl溶液后再转移到等渗盐水中发生的溶血现象一致，因此他认为造成冷冻溶血的主要原因是由于水逐渐变成冰导致胞内外的电解质浓度过高（也称为电解质盐损伤），该损伤通常会在-3 ℃～-40℃之间发生，所以在冷冻时需要快速通过该温区[145,146]。1960～1962年，Struma报道了当温度降低到-3℃以下时超过82%的水会结冰，此时残余溶液中电解质盐浓度将提高至0.85 M[34,125]，根据他们的经验红细胞最大可承受氯化钠浓度为0.75 M，如果浓度上升至0.85 M时会发生严重损害，比如表面脂质蛋白结构受损或者变性[36,147]。1968年，Meryman曾在Nature上否定了Lovelock的盐浓度低温损伤理论，他认为在慢速冷冻过程中红细胞发生的溶血并非由高浓度电解质本身造成，而是因为浓度不断提高的电解质（0.8 M以上）引起过高渗透压导致红细胞无法通过无限制地缩小体积达到渗透性平衡，从而在红细胞膜内外形成静态渗透压差造成溶血[137]。随后1970～1977年，Meryman提出细胞最小体积假说理论，并通过实验证明膜性质的改变是冷冻损伤的主要原因[148-152]。同一时期1968～1970年，Zade-Oppen在研究高渗溶血机制时得到了和Meryman几乎一致的结论[153-155]。1976年，Pegg认为Meryman静态渗透压差的理论并不合理，因为当细胞内蛋白质浓度过高时胞内溶液将变为非理想溶液，因此仅需要极小的水流即可保持膜两侧水活度相等，但冷冻过程中膜损坏导致阳离子泄漏已成不争的事实[141]。此外，Pegg建议可以补充Lovelock关于红细胞热休克的机理来解释慢速冷冻下高渗盐溶液对红细胞的损伤，比如高渗溶液会洗脱红细胞膜上熔点较低的卵磷脂，降低了膜上磷脂和胆固醇的相对比例，导致细胞膜柔软性变差，从而更容易受热应力影响发生溶血[156,157]。1973年，Farrant等人也同样强调了热休克对红细胞在冷冻过程中的损伤作用[158,159]。1979年，Araki通过实验证明了红细胞在浓盐水和缓慢冷冻中会释放富含胆固醇的囊泡，从而强力支持了Pegg的观点[160]。1980年，Williams等人认为红细胞的溶血还是取决于是否超过最小体积，而不是细胞内外的电解质浓度，热休克引发的溶血也与细胞体积的减小有关[161]。1981年，Mazur等人认为慢速冷冻下的红细胞是否存活更多地取决于未冻结水的比例，而NaCl浓度的增加仅为次要作用，因为冷冻过程中未冻结通道的缩窄和减少不仅增加了细胞与通道边界冰晶之间相互作用的机会，还增加了细胞间相互作用的机会，这些应力（比如剪切力、细胞形变）会直接损失低温下已经变脆的细胞膜[134]。1983～1989年，Mazur等人还针对未冻结比例假说补充讨论了慢速复温、细胞压积、等渗重平衡等条件改变后的一些影响[135,162,163]。1988～1991年，Pegg和Diaper认为将体积减小到单个临界极限值并不是慢速冷冻损伤的根本原因，而应该考虑到融化（再膨胀）阶段发生的质膜暂时性泄漏。他们还通过透析实验针对Mazur等人的未冻结比例假说进行讨论，认为Mazur等人的实验结果实际上是初始非等渗溶液下引起细胞体积的不同而造成的表面现象，尤其是这些细胞对随后冷冻和融化的敏感性不同，比如收缩的细胞更具抵抗力，而溶胀的细胞更脆弱，因此慢速冷冻损伤仍可以归因于冷冻复温过程中的溶液成分变化[164-166]。

以上讨论都是在慢速冷冻条件下开展的，过去对慢速冷冻的定义就是冰晶全部在细胞之外形成[141,167]。但对于快速冷冻来说，细胞内将不可避免的出现胞内冰，因此由胞内冰给细胞带来的机械损伤以及如何控制细胞内冰晶尺寸足够小就成为快速冷冻成功与否的决定性因素[167]。1962年，Strumia就曾指出冰晶尺寸比冰晶数量在对红细胞伤害方面要严重的多，另外冰晶大小和数量取决于降温速率，更快的降温速率会产生尺寸更小数量更多的冰晶，当温度降到-130℃左右时冰晶便停止生长[36,168,169]。1972年，Diller通过低温显微镜给出了红细胞冷冻过程中的胞内冰形成与降温速率直接相关的证据，比如当降温速率小于6℃/min时，胞内冰生成的概率为0%，一旦大于17℃/min时，胞内冰概率就上升到100%[170]。1976年，Nei通过电子显微镜研究了不同降温速率和不同甘油浓度下胞内冰的形成以及细胞膜形态在冷冻过程中的变化[171,172]。1981年，Fujikawa在快速冷冻红细胞实验中，给出了胞内冰的出现和生长会直接破坏磷脂双分子层中间疏水层结构，导致细胞膜受损的冷冻蚀刻的电子显微照片[173]。1984年，Pegg等人也通过冷冻断裂实验，在不同降温速率下同样也给出了不含或者含2 M甘油下胞内冰的电子显微照片，并发现当降温速率大于200℃/min后，原本无胞内冰出现的2 M甘油也会出现细小冰晶，对应的冷冻存活率也随之下降[174]。

3.3 降温速率与两因素假说：1970年，Mazur在Science上发表了一篇综述，整理了前人研究不同细胞的冷冻存活率和降温速率之间的关系，最早向世人呈现了低温生物学中最经典的“倒U型”存活率曲线[175,176]。1972年，Mazur等人正式提出了低温生物学中最负盛名的两因素低温损伤假说，该假说指出如果降温速率过慢，细胞内的水分全部流出胞外，细胞体积过度收缩，胞内溶质浓度过高，细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液下会受到伤害，称为溶液损伤（Solution effect）。如果降温速率过快，细胞内的水分来不及流出胞外，就会发生胞内冰现象，并且在复温过程中存在重结晶的隐患，称为胞内冰损伤（Intracellular ice formation effect）[177]。过快或者过慢的降温速率对细胞冷冻都是不利的，因此就存在最佳降温速率。在最佳降温速率下，细胞体积收缩适当，胞内电解质浓度虽有提高但还在细胞可承受范围内，细胞内的水分又不足以产生致命的胞内冰，从而确保了细胞经过冷冻后能够获得最高的存活率[124]。

其实降温速率本质上控制的是胞内未冻结水（也叫过冷水）的量，而未冻结水离开细胞的速率则取决于细胞膜对水的渗透性。以红细胞和酵母为例，前者有很高的水渗透性，后者则较低。因此在不含任何低温保护剂情况下，前者最佳降温速率（2 500～3 000℃/min[176]）远大于后者（10℃/min[176,178]）。1963年，Mazur在讨论冷冻过程中水传输模型时就曾预计无保护剂下的红细胞最佳降温速率在2 500～5 000℃/min，因为从模型仿真的结果可以看出大于5 000℃/min的降温速率会导致当温度降到-10℃（过冷10℃即可结冰）时红细胞内还残留大量的过冷水，从而存在胞内冰生成的风险[179,180]。1968年，Rapatz等人通过实验证明了红细胞的“倒U型”存活率曲线，测试了仅使用ACD抗凝剂、降温速率从1～15 000℃/min下全血红细胞的存活率，发现在1 600～3 500℃/min区间红细胞存活率达到最高60%～67%[180]。类似的1981年，Fujikawa也测试了仅使用等渗生理盐水、降温速率从3～11 500℃/min下红细胞存活率，发现3 500℃/min下存活率达到最高50%，再次呈现“倒U型”存活率曲线。此外他还通过扫描电镜证明了不同的降温速率会影响红细胞膜超微结构，比如当降温速率越慢，细胞膜外出现无膜颗粒的囊泡斑块将越大，降温速率越快，膜内出现由胞内冰导致的类似虫噬的斑点越多，而膜结构的改变与冻后溶血程度密切相关[173]。需要补充说明的是，ACD中由于葡萄糖的存在或者全血中由于血浆蛋白的存在相比仅用生理盐水将明显提高无保护剂下不同降温速率下红细胞的冷冻存活率[181]。虽然在不含保护剂的情况下仍有红细胞能够幸存，但有证据表明冷冻和复温过程中膜的渗透性会发生改变，导致红细胞原本低钠高钾的胞内环境转变为高钠低钾，红细胞仍遭受了低温损伤[151]。

如果降温速率继续往上提升至大于10 000℃/min的水平时，无保护剂红细胞的冷冻存活率会反弹，因为此时的降温速率已不属于两因素假说范畴，而是接近玻璃化，Luyet薄膜冻存牛红细胞以及Meryman液滴液氮冷冻ACD全血应属于此类，后者存活率可达80%～85%（如果再添加6.5%葡萄糖，存活率可达97%～98%）[15,167]。同样的，Huntsman也给出了液滴液氮冷冻ACD红细胞80%～90%的冷冻存活率数据，他也强调了ACD里面含有少量的葡萄糖会比使用无葡萄糖的EDTA更利于红细胞冷冻存活率的提升[182]。

降温速率的重要性不仅体现在无保护剂冷冻上，对已添加保护剂的红细胞来说，如果保护剂浓度和降温速率不匹配，红细胞的冷冻存活率也将受到很大影响。以人们最熟知的甘油为例，仍参考1968年Rapatz的报道，其中10%的甘油在5～150℃/min降温速率区间最高存活率可达97%，如果降温速率不在这个区间，尤其是不断地提高降温速率，存活率会迅速下降，比如添加10%甘油的存活率在1 600～2 000℃/min时甚至明显低于没有添加甘油的冷冻组，当在3 500～15 000℃/min时存活率仅剩5%～15%[180]。类似的，Chaplin、Krijnen和Meryman等人在临床上也发现降温速率和甘油浓度不匹配（比如过高）导致存活率下降的现象[25,28,84]，Morris、Miller以及Scheiwe等人也给出了含一定浓度甘油的红细胞随着降温速率提升冷冻存活率下降的实验结果[181,183,184]，并且他们都将其归因于胞内冰[175,179]，这与Nei以及Pegg等人给出的胞内冰显微照片结果一致[171,172,174]。回顾临床冷冻方案，20%低甘油快冻法使用液氮冷冻的降温速率≈100℃/min，40%高甘油慢冻法使用-80℃冰箱冷冻的降温速率≈1℃/min[11,94]，也可以看出随着甘油浓度增加，最佳降温速率也在逐渐降低。但对于非渗透性保护剂来说，最佳降温速率貌似不会受到保护剂浓度的影响。继续参考1968年Rapatz中10%的Dextran（原文中写的是Dextrose，这里应该理解为Dextran而不是Glucose[11]）冷冻红细胞，最佳降温速率在2 300～3 500℃/min，存活率最高达90%，和无保护剂下的红细胞最佳降温速率温区1 600～3 500℃/min基本一致，而且全降温速率范围下的存活率都有提升，但仍不及渗透性保护剂在最佳降温速率下的最高存活率[180]。虽然非渗透性保护剂更适合快速冷冻，但也出现过例外的案例，比如40% PVP，不管降温速率是慢还是快对红细胞冷冻而言都可以获得较高水平的冷冻存活率[181]，甚至也有报道说PVP可以在慢速冷冻下达到95%的冷冻存活率[41,44]。

3.4 低温保护剂保护机理：对红细胞来说甘油还是首选的低温保护剂，也是公认的无毒渗透性添加剂，而DMSO的主要缺点是其可能的毒性（大于1 M）[17,125]。甘油可以束缚住水，使其无法结晶，但仍可以作为溶剂使用，从而降低了电解质浓度，减小慢速冷冻过程中对细胞的伤害[167]。1954年，Lovelock通过定点降温至-80℃的冷冻方式研究了十多种醇类、酰胺类、糖等中性低分子量溶质对红细胞的保护作用，并从溶液的依数性角度认为保护剂必须渗透进细胞才能给细胞提供保护，而且保护所需溶质的摩尔浓度与其分子量成正比，并认为最理想的保护剂就是甘油[185]。1962年，Doebbler等人通过快速冷冻的方式研究了二十多种糖类、醇类、聚合物等保护剂，认为尽管保护水平取决于降温和复温条件，但是保护剂活性与保护剂提供的潜在氢键基团浓度相关。他们认为随着冷冻进行，游离水数量减少，假设红细胞表面的一部分水和游离水不同，那么保护剂溶液中的氢键可以起到稳定细胞水合表面的作用[186]。很多经典的低温保存类综述详细阐述了渗透性和非渗透性保护剂保护原理，现归纳总结如下[11,124,141,175,187-191]。

渗透性保护剂之所以能够保护细胞，主要因为：（1）能够高度溶于水，有效降低凝固点并降低溶液化学势，减小冰晶形成量；（2）能够渗透进细胞，降低冷冻过程中逐渐增高的电解质浓度并防止细胞过分收缩；（3）具有粘度的渗透性保护剂溶液可以有效的保护细胞膜，防止细胞堆积造成机械损伤；（4）消除过冷现象以及降低共晶对细胞的伤害；（5）4～6 M高浓度下无毒，从而允许慢速降温；（6）如果渗透性浓度较低，则需要提高降温速率来防止胞内冰形成。需要注意的是，渗透性保护剂的保护效果主要取决于保护剂与细胞内外溶质的摩尔比，也就是依数性，即取决于物质溶解的浓度而不取决于它们的性质[124]。

非渗透性保护剂之所以能够保护细胞，主要因为：（1）冷冻前能够促进细胞脱水，降低冷冻过程中胞内冰损伤的概率；（2）通常生效于快速冷冻过程中，拥有更强的和水分子形成氢键的能力，可以“固化”胞外溶液，抑制冰晶生长并减小冰晶的尺寸，但对慢速冷冻保护能力有限，且依赖于快速复温和深低温储存；（3）对细胞膜具有更好的保护作用，稳定细胞膜表面大分子构象；（4）具有较高的玻璃化转变温度以及更强的玻璃化能力，能够稳定玻璃体；（5）有利于降低洗涤过程中由低渗环境造成的溶血。需要注意的是，非渗透性保护剂通常分子量较高，因此溶液的总摩尔浓度远低于所需甘油基混合物中的摩尔浓度，凝固点降低程度较小（凝固点为与溶解的溶质的浓度成正比）[192]。

最简单的有关渗透性和非渗透性保护剂保护细胞的机理可以从防止胞内冰形成的角度去理解，例如渗透性保护剂是通过渗透进入细胞替代胞内水来防止胞内冰形成，而非渗透性保护剂是通过在胞外构建高渗环境使得细胞脱水防止胞内冰形成[193]。此外，不可以忽略的是，添加保护剂的意义除了在于进一步提高存活率，更重要的是能将降温速率控制到人们可方便操作的地步。

3.5 复温、压积及储存等：关于冻后复温速率方面，红细胞复温过程通常使用37～45℃水浴复温（复温速率300～450℃/min[39,40,189,194]），属于典型的快速复温，也有报道说红细胞最高可以承受的温度为42～43℃[84,192]，像之前讨论的最佳降温速率都是在快速复温的前提下开展的。对于高甘油慢冻来说，复温速率对存活率的影响并不重要，选择快速复温的目的只是为了减少融化过程消耗的时间，尤其在紧急情况下，哪怕20 min的复温解冻时间都过长[84,94]。因为和降温过程类似，高浓度的甘油同样可以限制复温过程中冰晶的生长。不过对于低甘油以及非渗透性保护剂快冻来说，快速复温通常是必备的。因为快速冷冻下胞内冰较小，由于小冰晶热力学相对不稳定，很容易在复温过程中发生重结晶进而生长成有害的大尺寸冰晶，最终导致红细胞的冷冻存活率下降[126,175,183]。1976年，Miller使用含2 M甘油的红细胞并控制复温速率从0.47℃/min上升到550℃/min，在600℃/min降温速率下冷冻存活率从10%上升到70%，在180℃/min降温速率下冷冻存活率从75%上升到90%，并认为冷冻存活率对缓慢复温的敏感性应归结于复温期间的重结晶[183]。2014年，Deller在使用21.5%HES在-78℃干冰异丙醇浴冷冻红细胞的实验中发现，在使用45℃水浴复温后冷冻存活率有80%，但是23℃室温复温后冷冻存活率仅25%[195]。此外早在1958年，Meryman液滴液氮冷冻全血红细胞时发现水浴复温温度从37℃提升到45～48℃，存活率可以提升4%～5%，并且他在当时就提到可以使用热辐射或者微波辐射来提高复温速率，但由于当时的一些技术瓶颈，所以并未取得突破[167]。如今随着科学技术的发展，已经涌现出各种成熟先进的超快速复温方法，比如基于纳米颗粒的电磁/光热复温技术等，不过这些复温技术还未曾在红细胞冷冻中应用报道过[196]。

值得一提的是，红细胞复温的速率一定要快并不是绝对的概念。1976年，Miller在研究不同复温速率对红细胞冷冻存活率的影响时发现一个有意思的现象：使用2 M甘油以0.27℃/min或者1.7℃/min冷冻红细胞后再用1℃/min或者更慢的复温速率处理后的冷冻存活率依然能到60%～80%，但如果使用160℃/min速率复温，冷冻存活率会迅速降到只有19%[183]。类似的，1967年Meryman也报道过1 M甘油下以0.3℃/min冷冻红细胞后再以0.3℃/min复温比以30℃/min复温能获得更高的存活率，但是复温速率改变对以10～30℃/min速率冷冻的红细胞几乎没有影响[193]。1978年，Souzu等人也在定点慢速降温下发现使用1.5 M和2 M甘油冷冻再对红细胞慢速复温，冷冻存活率存在提升现象，但复温速率的改变对更低浓度的甘油几乎无任何影响[126]。因此，慢速复温只对慢速冷冻的红细胞才会起到一定效果，换言之与慢速冷冻相关的伤害也就不能完全归因于长时间暴露于溶液效应之中，可能的解释是快速复温带来的渗透休克或者冷冻过程中溶质加载或许对红细胞的冷冻存活率也有影响[183, 190]。

红细胞压积或者红细胞比容，可以间接反映红细胞数量大小及体积，比如10%的红细胞浓度大约为1000 million/mL（1×1012/L或者1 million/mm3）[197]。早在1950s～1960s期间人们就已经发现红细胞压积越高，冷冻存活率越低的现象，而且压积不同还会影响后续洗涤溶血水平[36,42,48,53]。1967～1968年，Nei在研究红细胞（兔）-2℃～-10℃的冷冻存活率时就曾发现压积较高的红细胞（≈40%）比压积较低的（≈4%）更容易溶血[198-200]。1981年，Pegg等人研究了不同压积下（从4%到83%）使用2.5 M甘油冷冻红细胞至-60℃～-65℃的溶血率变化数据（从1%上升到16%），其趋势和Nei的结果一致，并且还将高压积损害和器官冷冻联系到一起[201]。同样在1981年，Nei将该现象称为“堆积效应（Packing effect）”，并认为可以通过提高甘油浓度来降低其影响，还用冷冻刻蚀电子显微镜实验证实所有红细胞会被限制在甘油网络中并被具有粘性的甘油溶液覆盖，从而保护细胞膜防止因过量细胞挤压而遭受机械损伤[202]。1982年，Scheiwe等人使用自制毛细管研究HES冷冻红细胞效果时也广泛对比了不同压积和降温速率对红细胞冷冻存活率的影响，其中在仅含PBS无HES添加下当红细胞压积从4%提高到80%，在最佳降温速率4 600～4 900℃/min下，冷冻存活率从76%降低到56%，而在使用18% HES后当红细胞压积从15%提高到72%，在全范围降温速率下冷冻存活率从75%降低到55%。他们认为压积高的红细胞在冷冻过程中会向外流出更多的胞内过冷水，稀释降低了原本应该升高的胞外电解质浓度，从而缩小了胞内外渗透差，导致胞内水残留并遭受胞内冰损伤。另外，他们还发现由压积升高引起的稀释效应会降低胞外HES浓度从而导致最佳降温速率升高[184]。1983年，Pegg等人提出传统两因素假说不适用于“堆积效应”的解释[203]。次年，Pegg等人在研究2 M甘油冷冻保存红细胞时认为“堆积效应”应归因于未冻结液体通道过窄导致细胞堆积以及机械应力的影响，并发现当冷却速率超过100℃/min时，“堆积效应”更依赖于降温速率，因为降温速率越高未冻结液体通道数量和形态会变的更多且更窄，冷冻存活率也就越低；而当降温速率小于100℃/min时，“堆积效应”更依赖于复温速率，因为慢速冷冻导致的极窄通道可以通过提高复温速率减小再结晶来降低其影响，冷冻存活率也就越高。此外，Pegg等人还发现在使用2 M甘油冷冻和100℃/min复温速率时，红细胞压积若增高，最佳降温速率就会降低的现象[174]。2000年，Wagner等人在研究100 mL大体积红细胞慢速冷冻时认为如果对细胞膜给予充分保护，则可以减弱甚至避免“堆积效应”带来的不利影响，该保护作用既可以由高浓度甘油也可以由不具冷冻保护作用的生化稳定剂来实现，此外这些由临床药物组成的生化稳定剂还可以将甘油慢冻所需浓度从40%降低到20%，他们还认为由压积增大带来的损伤并非是冷冻损伤而是细胞生化损伤[204]。

关于储存温度方面，高甘油慢冻法应该储存在-60℃～-80℃的机械冰箱里，低甘油快冻法应该储存在-140℃～-150℃液氮气相中，美国和欧盟都规定了这两种方法保存时间为10年，后来更新过的欧盟标准甚至允许保存30年[6,114,205,206]。在已发表文献中研究最长的年限，-80℃冷冻为37年[13]，-196℃冷冻为19年[71,207]（其中冷冻储存温度在-165℃气相液氮和-196℃液相液氮之间无差别），甚至Sumida曾大胆推测红细胞在-80℃可以保存500～1000年，在-196℃可以保存10 000年[112]。不过需要注意的是，使用低甘油液氮冷冻之后的红细胞不能再放回-80℃保存，因为原本快冻生成的无害小冰晶会在-70℃～-80℃下继续生长变大，从而导致红细胞冷冻存活率下降[105,167]。类似的也有研究报道过在-150℃液氮气相冷冻保存的20%甘油化红细胞，由于运输过程中气相温度没有控制好，在高于-120℃后发现了明显的溶血现象[115]。1973年，Nei通过冷冻刻蚀实验证明了30%甘油冷冻的红细胞在使用-150℃氟利昂快速冷冻后再浸入液氮，然后转移至-80℃乙醇浴保存2个星期后，能够清晰拍摄到红细胞内生长出冰晶的电子显微照片[208]。1972年，Meryman和Hornblower报道高甘油慢冻法时也曾指出，在高于-60℃冷冻几个星期后，红细胞内钾离子水平并不让人满意[84]。更早1950s～1960s期间有人做过-45℃下冷冻储存甘油化红细胞，发现存活率以每年损失5%递增[209,210]，也有人发现用15%甘油在-15℃冷冻红细胞后虽然冷冻存活率明显低于在-79℃冷冻保存的红细胞，可是存活下来的红细胞仍能实现正常的体内存活率[211]。与存储温度相关的另一个研究报道是，2000年Valeri等人先使用40%甘油将红细胞冷冻到-80℃后再转移到-40℃或者-20℃保存4周或者2周，然后再转移回-80℃后再进行复温洗涤，发现仍能够得到较理想的临床输血结果[212]。

除了以上提到的低温保护剂、降温速率、复温速率、细胞浓度、储存温度等主要因素之外，还有其它一些细节因素也需要考虑到红细胞冷冻保存之中，比如种冰以及共晶对红细胞冷冻的影响，过冷度和胞内冰之间的关系，不同形态细胞在冷冻过程中的差异，液体冷藏时间对冷冻存活率影响等。

4 红细胞低温保存新方法

4.1 新型低温保护剂：海藻糖是自然界动植物和微生物中广泛存在的一种非还原性二糖。相比其它二糖海藻糖具有较高的玻璃化转变温度，尤其在干燥过程中能形成稳定的玻璃体，帮助生物体储存能量、吸收水分，用来对抗冷冻或者缺水的极端环境[213,214]。通过与磷脂的极性头基相互作用，海藻糖相比更容易结晶的蔗糖在减少膜融合、稳定细胞膜等方面更有效[215,216]。因此一直以来围绕海藻糖对红细胞进行冷冻报道的研究很多，不过也有一些其它如渗透压调节剂等新型保护剂在尝试使用。

1997年，Pellerin-Mendes等人测试对比了不同浓度的海藻糖和Dextran液氮冷冻保存人红细胞的冷冻存活率以及各项冻后生化指标，和17.5%甘油组的92%冷冻存活率相比，最优终浓度0.5 M的海藻糖可达81%，但和15%的Dextran能达90%的冷冻存活率相比仍然较低，对此Pellerin-Mendes等人将其归因于海藻糖只有同时在胞内外出现才能发挥最大冷冻保护作用[217]。2017年，Huang等人在研究种冰和脱水机制对不同生物细胞冷冻保护作用时，发现在冷冻人红细胞前使用海藻糖对细胞进行预脱水至最小体积，相比为了减小复温时发生的重结晶而对细胞种冰，更能提升红细胞冷冻存活率，最终在种冰和0.33 M海藻糖预脱水的双重作用下冷冻存活率达到78%[218]。2020年，Shen等人重新测试了不同浓度下海藻糖预脱水对人红细胞液氮冷冻效果，并利用EP管在仅含0.4 M海藻糖的情况下将冷冻存活率提升至90%，为了进一步提高冷冻存活率并降低残留的胞内冰损伤，他们还在0.4 M海藻糖基础上添加5%甘油后最终实现95%的冷冻存活率，和传统17.5%甘油96%冷冻的存活率效果相当，而且还简化了洗涤步骤，确保洗涤在30 min之内完成，洗涤回收率可达88%[219]。

通常人们认为脂质体可以通过脂质和胆固醇交换来修饰细胞膜，从而改变物理特性，有利于低温下稳定细胞形态和结构。2012年，Stoll等人研究了不同脂质体对HES和海藻糖液氮冷冻人红细胞的影响，发现经过孵育处理的脂质体可以提高海藻糖冷冻红细胞的存活率（从77.8%到89.7%），也可以提高HES冻后红细胞96 h长期存活率（从66.5%到77.5%），但效果最好的还是直接使用12.25% HES和0.29 M海藻糖一起冷冻红细胞，冷冻存活率可达97.8%，96 h长期存活率可达81.8%。不过他们发现冷冻过程中海藻糖会进入细胞（从冻前胞内5.1 mM提高到大于100 mM），并认为胞内海藻糖有利于提高红细胞复温后的稳定性[220]。类似的由冷冻导致非渗透性保护剂进入红细胞内的结论，Daw在40%蔗糖冷冻人红细胞实验中也报道过[221]，Morris也曾提到过高浓度的蔗糖（比如超过40%）会在冷冻复温过程中进入细胞[181]。

还有一些在微生物中广泛存在的以两性电解质为主的渗透压调节剂也被应用到红细胞冷冻保存研究之中，比如四氢嘧啶、甜菜碱、各种氨基酸等。2014年，Assal等人使用以4.5%四氢嘧啶为主的保护剂，结合纳升级液滴打印技术，通过冷冻纸收集人红细胞液滴后直接浸入液氮实现玻璃化，并系统地从形态、力学、功能等方面详细评估了冻后红细胞各方面指标[222]。2017年，周洋等人使用3%的四氢嘧啶来代替国产57%复方甘油溶液中的3%乳酸钠，可将原来84%的人红细胞慢速冷冻洗涤回收率提高到89%，并能有效维持红细胞正常体积[223]。2017年，Yang等人研究了脯氨酸、甘氨酸和牛磺酸对羊红细胞液氮冷冻效果，最好的是4.5%脯氨酸，冷冻存活率可达72%[224]。2019年，Dou等人使用1.5 M脯氨酸和0.2 M海藻糖一起液氮冷冻羊红细胞，得到88.8%的冷冻存活率[225]。2019年，Sui等人使用15%的甜菜碱研究兔红细胞液氮冷冻，存活率可达69%，如果继续添加少量的膜保护剂，如蔗糖、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸，冷冻存活率可提升至90%[226]。

至于其它类别的新型低温保护剂也有若干报道。2019年，Liu等人使用0.1%合成的带海藻糖官能团的糖肽PLR8T13将原来仅使用0.36 M海藻糖情况下液氮冷冻羊红细胞的冷冻存活率从49.1%提升到75%[227]。2020年，Liu等人还通过改进糖肽PKDF1T将冷冻存活率提高到87.3%[228]，不过貌似比修饰改性聚谷氨酸PGA-g-PEA的90%冷冻存活率略低一点[229]。2020年，Cao等人发现2%海藻酸钙水凝胶纤维封装对人红细胞在低浓度甘油下有明显提升作用，但对10%以上浓度的甘油和DMSO来说无效甚至起到反作用[230]。

4.2 胞内递送海藻糖：2000年，Eroglu等人在Nature报道了通过基因改造的金黄葡萄球菌溶血素突变体能在细胞膜上形成可逆的小孔，从而能向胞内加载低浓度（0.2 M）的海藻糖，长期冷冻后最终可使80%以上的3T3成纤维细胞和70%以上的人类角质细胞存活[231]。该结果让人意识到海藻糖只有在细胞膜的两侧才能发挥出最大的冷冻保护作用，因此人们开发出一系列方法将海藻糖输运到细胞内，比如冷冻或者渗透压诱导的膜相变、聚合物或者多肽诱导的膜通透、溶血素类的成孔剂、脂质体或者纳米颗粒封装递送、电穿孔或者超声辅助、微注射或者液相内吞、基因工程下的内源合成等[232,233]。其中很多技术也被应用到红细胞的冷冻干燥中，这里主要介绍一些典型的非冻干用的通过胞内递送海藻糖技术提升人或者羊红细胞冷冻存活率的案例。

2007年，Guo等人发现在使用40% PVP和20%人血清蛋白在-80℃中速冷冻人红细胞前，先经过0.8 M海藻糖或者葡萄糖37℃3 h孵育处理（其中胞内海藻糖和葡萄糖浓度分别约为16.7 mM和26.5 mM，孵育溶血率分别35%和5%），冷冻存活率相比未经孵育处理的显著提高（从40%多提高到90%多），但单独使用0.8 M海藻糖或者葡萄糖冷冻几乎没有存活。虽然胞内葡萄糖冷冻效果较好，但冻后60%的PS外翻率却比胞内30%海藻糖要高很多[234]。2008年，Guo等人在无冷冻实验中发现葡萄糖孵育过程中添加大于800 mM的亮肽素或者大于100 mM海藻糖/蔗糖可以将原来红细胞膜上PS暴露百分比降低至10%或者5%以下[235]。2009年，Guo等人更换PVP为Dextran并选择液氮冷冻方案，发现单独使用单糖（葡萄糖，果糖，半乳糖）孵育可以增强40%Dextran液氮冷冻红细胞的冷冻存活率和膜完整性，胞内单糖还能通过参与胞内糖酵解稳定红细胞代谢功能，另外单糖中的半乳糖冷冻保护作用最好，但葡萄糖孵育引起的长期溶血率过高的影响因素还未知[236]。2011年，Guo等人认为葡萄糖和低聚糖（海藻糖、蔗糖、麦芽糖或棉子糖）按照3:1混合且总浓度控制在0.4 M后孵育红细胞，再用40%Dextran液氮冷冻后红细胞的各方面指标情况（比如渗透脆性和PS外翻）效果会更好，最终冷冻存活率可达95%并有效解决了后期长期溶血率的问题[237]。

2008年，Holovati等人通过荧光标记实验证实了使用挤出方法合成的含有单层海藻糖的脂质体可以在不损伤细胞膜的前提下通过和人红细胞膜融合从而向胞内输送海藻糖，并通过控制膜成分改变带电属性等方法可以将原来输送不到1 mM海藻糖提高到≈15 mM[238,239]。2009年，Holovati等人在使用典型慢、中、快三种降温速率冷冻人红细胞时发现，在胞外仅含生理盐水的情况下，经过带负电荷的包裹海藻糖的脂质体37℃ 4 h孵育处理的红细胞的冷冻存活率可从20%水平提高到40%水平，如果胞外含0.3 M海藻糖，冷冻存活率可从30%水平提高到60%水平。不过让人意外的是，当胞外使用脂质体替换0.3 M海藻糖时，冷冻存活率比60%还要高一点。还有使用同样带负电荷但包裹的是生理盐水的脂质体处理的红细胞在胞外含有0.3 M海藻糖的情况下，冷冻存活率也能达到60%水平。该结果说明提高红细胞冷冻存活率的并不是利用脂质体向胞内递送的≈15 mM海藻糖，而是因为带负电荷的以单层囊泡形式出现的脂质体能够通过和红细胞膜充分相互作用来增强红细胞抗冻能力[240]。当然≈15 mM胞内海藻糖不能提高冷冻存活率也符合人们对生物细胞内至少需要100～200 mM海藻糖才能达到胞内保护作用的认知[241]。

2010年，Lynch等人使用一种合成的pH响应的生物聚合物PP-50，可以显著提高红细胞膜对海藻糖的通透性，将其与0.36 M海藻糖、羊红细胞一起经过pH 7.05 37℃ 9 h孵育后，胞内海藻糖浓度可达123 mM，在液氮冷冻实验中，相比未孵育仅胞外含有0.36 M海藻糖的实验组，冷冻存活率可由62.2%提到高到86.6%，其缺点是由于孵育时间过长，孵育过程溶血率可达20%以上，而且慢冻实验下胞内海藻糖对冷冻提升并不明显[242]。2011年，Lynch等人在人红细胞PP-50加载海藻糖实验中，将胞外0.36 M海藻糖孵育浓度提升到0.7 M，可实现胞内251 mM海藻糖浓度的加载，经液氮冷冻后相比胞外仅含0.7 M海藻糖的实验组，可将冷冻存活率由不到60%提升到75%，并且他们还研究了海藻糖装载量、细胞体积、冷冻存活率之间关系，发现只有装载了最大浓度的海藻糖的红细胞才能接近等渗体积，从而获得最高的冷冻存活率[243,244]。2020年，Chen等人使用改进的pH响应的拟肽聚合物PLP-NDA18对羊红细胞进行胞内海藻糖介导递送实验，发现在pH 6.1 37℃ 15 min孵育下就能迅速实现胞内177.9 mM海藻糖递送，孵育溶血率仅为16.7%，经液氮冷冻后相比仅胞外含有0.36 M海藻糖的实验组，冷冻存活率可由69.4%提高到90.3%，和PP-50对比递送效率明显提升（从9 h孵育实现35%递送效率提升至15 min孵育获得49.4%递送效率）[245]。

2017年，Stefanic等人使用经稳定剂处理后的表面带双层正负有机电晕的胶体状磷灰石纳米颗粒来和羊红细胞膜产生特异相互作用，促进海藻糖渗透进红细胞内，并通过37℃ 7 h孵育以及控制pH 6.5实现最多50.9 mM海藻糖渗透（孵育溶血最高6.8%），相比pH 7.4下单独使用0.35 M海藻糖，经液氮冷冻并转移-80℃冰箱储存一天后冷冻存活率可以从51.8%提升到90.7%。此外，Stefanic等人还通过双层脂质模型和荧光分子实验证明弱酸性的pH在调整磷灰石纳米颗粒的生物活性方面的重要作用，并认为磷灰石纳米颗粒增强介导的无孔渗透机制可能是低温保护剂或者其它药物原始递送机制[246]。不过遗憾的是Stefanic等人并未做人红细胞相关实验，因为羊红细胞和人红细胞部分特性方面存在较大差异，例如羊红细胞呈球形且仅占人红细胞体积的三分之一[7]，羊红细胞对甘油的渗透性相比人红细胞要低60倍左右[247]等。此外，CPD或CPDA对羊红细胞会造成轻微损害，因此更推荐肝素作为羊红细胞首选的抗凝剂[7]。总之，羊红细胞的冷冻方案不能完全照搬到冷冻人红细胞上来。

4.3 冰重结晶抑制剂：冰重结晶抑制（Ice recrystallization inhibition，IRI）的思想来源于从自然界极地鱼类、冬眠昆虫、耐寒植物等生物体上发现的能够避免自然冻结的抗冻（糖）蛋白（Antifreeze proteins or glycoproteins，AF(G)Ps），具有典型的热滞性、重结晶抑制性、动态冰生成等特点，可以通过调控冰的形成方式（比如调节冰核，控制冰的形状，抑制冰生长和重结晶等）来保护生物活体免受低温伤害[248-250]。

1992年，Carpenter等人曾报道使用重组I型AFP（Antifreeze protein，抗冻蛋白）来提高人红细胞的冷冻存活率，他们发现在23% HES液氮冷冻中加入低浓度30～60 μg/mL的AFP能够在次优复温速率下（室温自然复温，非水浴快速复温）将红细胞冷冻存活率从55%提升到88%，证明了AFP在抑制重结晶中的重要作用，可是当继续提高AFP浓度到1.54 mg/mL时溶血率会大幅度增加，通过冷台甚至观察到出现了破坏性双锥体冰晶。他们认为AFP虽然具有很强的重结晶抑制能力，但其本身并不具有冷冻保护作用，另外在已有HES液氮冷冻并选择快速复温的情况下不管是否添加AFP冷冻存活率都能达到97%，不过值得注意的是AFP可以降低洗涤过程中的溶血率[194]。1994年，Ishiguro使用低温冷台通过定向凝固实验，发现添加20 mg/mL的AFP能够显著改变20%甘油形成的冰晶形态，使得原本应该存活的红细胞因尖锐冰晶的存在而全部死亡，也间接说明了胞外冰晶机械损伤对即使已经受到甘油保护的红细胞来说仍具有伤害作用[251]。1996年，Chao等人扩展研究了重组III型AFP中不同突变体辅助HES冷冻保存人红细胞的机理，发现蛋白本身相对的热滞后活性和抑冰能力对提高红细胞冷冻存活率至关重要[252]。

考虑到AF(G)Ps潜在的免疫原毒性、过高生产成本、易形成动态针状冰晶等问题，近些年人们不断地寻找或者努力合成各种和AF(G)Ps一样具有抑冰效果但能克服其缺点的冰晶抑制剂，比如小分子化合物、高分子聚合物、聚两性电解质、纳米材料等[196]。

在小分子化合物方面，Ben课题组设计合成了一系列糖苷小分子（MW＜340 Da），比如酚类糖苷小分子、芳基糖苷小分子等来研究对人红细胞冷冻保存效果。2015年，Ben课题组通过两步冷冻法模拟慢速冷冻（-5℃种冰，然后以1℃/min降温至-40℃/-50℃再放入-80℃干冰）向15%的甘油中添加不同的可渗透性酚类糖苷小分子110 mM β-PMPGlc和30 mM β-pBrPh-Glc（2019年补充了部分实验），将原来只有25%的冷冻存活率提高30%～50%，最高接近80%，但是对于20%的甘油慢冻提升并不明显，而且离40%甘油慢冻98%左右的冷冻存活率相比仍具有较大差距[253,254]。2016年，Ben课题组还设计了反复冻融实验（不种冰直接放入-80℃干冰后复温至-20℃反复5次）来验证向15%甘油中添加芳基糖苷小分子对重结晶的抑制作用，发现红细胞冷冻存活率可由原来不到40%提升到近90%，和40%甘油反复冻存效果几乎一致，还通过冷台证明了抑冰剂的加入可以降低冰/水比例从而减小溶液损伤[255]。2016年，Ben课题组还发现一些抑冰能力较差但却能作为有效冰核抑制剂的小分子β-PMP-Gal也能显著提高15%甘油慢冻存活率，并通过抑制AgI液滴成核实验认为小分子化合物低温保护的有效性并不体现在抑制重结晶，而是抑制冰成核[256]。

在高分子聚合物方面，2014年，Gibson课题组发现聚乙烯醇PVA比常规非渗透性保护剂如PEG、HES有更显著的抑冰效果，并在-78℃异丙醇干冰浴快速冷冻羊红细胞实验中，单独使用0.1% PVA就可以达到40%冷冻存活率。随后在人红细胞中向21.5% HES中添加0.1% PVA并采用23℃室温慢速复温可将原来只有20%多的存活率提升到60%，但仍不及45℃水浴快速复温得到的80%存活率[195]。2015年，Gibson课题组改变冷冻方式，使用更常规的液氮冷冻，重新研究了不同浓度的PVA对17.5% HES冷冻羊红细胞的提升作用，效果最好的是0.5% PVA，在23℃室温慢速复温下冷冻存活率提升10%～15%到40%左右，42℃水浴快速复温下冷冻存活率提升30%到80%以上，并通过实验发现可以利用PVA来降低红细胞转移-20℃储存后的溶血率[192]。2016年，Gibson课题组还将0.1%的PVA和5%仿生高度羟基化的嵌段蠕虫共聚物结合起来，利用PVA抑制重结晶以及蠕虫共聚物热敏特性（20℃以上为凝胶态，12℃以下成液态），通过液氮冷冻4 ℃超慢速复温实现68%的羊红细胞冷冻存活率，和同等实验条件下20% HES外加0.1% PVA的70%存活率基本一致，更重要的是该方法可以通过温度控制，比如从4℃升温到20℃，能将原来呈液态的红细胞悬液转变为凝胶态，为红细胞的储存和运输提供了新的解决思路[257]。

在聚两性电解质方面，已经有人成功将聚赖氨酸、聚甜菜碱以及聚脯氨酸等聚两性电解质用于人或动物细胞的冷冻保存[258-261]。在红细胞方面，2015年Gibson课题组自行合成的带氨基和羧基的聚两性电解质，在液氮冷冻室温慢速复温下向HES加入0.5%的聚两性电解质可将仅使用HES的羊红细胞的冷冻存活率从20%提升到30%，添加2%的聚两性电解质甚至可以提升到60%[262]。2021年，Wang课题组在没有使用HES下直接使用6%的聚（D/L-丝氨酸）对羊红细胞进行液氮冷冻后45℃水浴快速复温，冷冻后存活率最高达52.3%，而单独HES冷冻仅有31.8%存活[263]。

在纳米材料方面，2017年Wang课题组利用1%的氧化物准碳氮量子点OQCN[264]、2019年Brinker课题组利用0.05%的基于锆Zr的金属有机骨架MOF纳米颗粒[265]，均使用和Gibson课题组一样的液氮冷冻4℃超慢速复温实验方法[257]，达到40%～50%的冷冻存活率，略高于使用21.5% HES的不到40%的冷冻存活率，不过Wang课题组使用的是羊红细胞，Brinker课题组使用的是人红细胞。2020年，Wang课题组还使用水热碳化合成的来自葡萄糖的2%的碳点G-CDs对羊红细胞进行液氮冷冻45℃水浴快速复温，实现60%的冷冻存活率，而单独21.5%的HES冷冻仅有40%存活[266]。

5 总结 红细胞冷冻保存已经发展了70余年，从最早偏向保存过程和经验的发展，逐渐转移到低温冷冻损伤和保护剂机制的基础研究，再到最新的抑冰和纳米材料等先进低温保存技术探索，整个红细胞冷冻保存的历史其实就是低温生物学发展的历史。作为低温生物学中最成熟和最广泛的临床技术应用，临床输注冷冻红细胞的成功来源于多方面的协同合作，其中既有低温生物学家在积极探索冷冻损伤机理和并提出预防冷冻损伤方案，也有生理学家和临床工作者做了大量的冻后细胞功能评估和临床实验，还有电子机械工程师不断完善和开发冷冻、储存、运输和冻后洗涤红细胞的自动化设备[125]。

虽然人们曾畅想过最理想的冷冻方法是向红细胞制剂中添加允许输注人体的物质，冷冻复温后的游离血红蛋白也在安全范围之内，从而实现免洗涤直接输注[39,102]。但至今仍然没有寻到一种适用范围广、操作简单、无毒价廉，并且保存效果能媲美甘油的低温保护剂。既然避免不了保护剂的使用，那么人们洗涤的目标就是在最短的时间内使用最少体积的洗涤液得到最高的红细胞回收率[110]。在面对自然灾难和战争等特殊情况时，冷冻红细胞的价值尤为重要，特别是军队对非甘油冷冻红细胞的新技术非常感兴趣，因为在紧急情况下花费大量时间在洗涤红细胞上是不被允许的，非渗透性保护剂在冷冻红细胞中仍具有一定发展空间[267]。

随着生物材料、纳米科技、工程技术的飞速发展，21世纪开始已经出现了很多新型的极具潜力的红细胞低温保存技术。但不可否认的是这些先进的低温保存技术大多仍然停留在实验室研究阶段，距离临床应用还有很长的路要走，如一些新型的低温保护剂面临能否获得FDA批准的问题、海藻糖孵育递送过程溶血率仍然较高、冰重结晶抑制剂无法摆脱传统保护剂依赖或者单独使用冷冻存活率较低（最高才60%～70%），以及绝大多数新技术实际实验中冷冻体积太小（仅1-2毫升甚至几百微升），部分技术甚至还停留在动物红细胞的测试上。尽管如此，我们依然相信这些先进的冷冻保存技术会随着科技的发展不断进步，上述缺点在将来也会被克服，所有的冷冻保存方案最终都会朝着安全高效的方向发展。

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