不同乳酸菌发酵羊栖菜浆的工艺研究

申 亮，毕诗杰，王小瑞，刘红英

（1. 河北农业大学 海洋学院，河北 秦皇岛 066000；2. 河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000）

乳酸发酵是指微生物以糖类为发酵底物，经无氧酵解而生成乳酸的发酵过程。而这类以糖类为发酵底物，主要产物为乳酸的无芽孢、革兰氏染色为阳性的细菌称为乳酸菌（Lactic acid bacteria）［1-3］。乳酸菌是一类对宿主有益的活性微生物，其可以改善肠道菌群结构，维持肠道的微生态平衡，提高宿主的免疫力等功能［4］。但是具有益生功能的乳酸菌来源狭窄，多从酸奶中筛选得到，因此找寻可作为是潜在的优质乳酸菌的自然资源库是非常重要的。

羊栖菜（Sargassum fusiforme）习称小叶海藻，又名玉草、海大麦、鹿角尖等，属于褐藻门马尾藻属植物［5-7］。羊栖菜含有丰富的多糖、食物纤维素、多种维生素、矿物质和多种微量元素，且含有人体所需的18 种重要氨基酸，包括8 种人体不能合成的必须氨基酸［6-9］，具有抗肿瘤、抗氧化［10］、降血糖、降血脂等作用［11-13］。然而目前羊栖菜的加工还处于粗加工阶段。胡嘉鹏以羊栖菜为主要原料制成具有海产食品独特风味与营养价值的调味酱［14］。陈显群在面粉中直接添加羊栖菜超微粉碎粉，加工成羊栖菜面包［15］。与其他褐藻门海藻如海带等相比，羊栖菜加工产品比较单一，加工技术匮乏，利用率不高。因此如何利用羊栖菜的营养价值与生理功能成分，研究开发新的生产工艺来提升羊栖菜的精深加工是急需迫切解决的问题。

本研究以羊栖菜浆为底物，结合乳酸菌发酵多糖产生大量乳酸菌这一特点［16］，利用乳酸菌进行发酵得到一种富含活性乳酸菌的羊栖菜浆。将羊栖菜和乳酸菌的营养价值相结合，产生大量乳酸菌，而且在发酵过程中乳酸菌对羊栖菜的分解产生有机酸等附加营养成分，这对开发羊栖菜功能型产品，提高羊栖菜资源的利用率，提高羊栖菜产业附加值有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：羊栖菜，渤海养殖，秋季采收，养殖时间为10 ～12 个月。

试剂：脱脂乳粉：美国唐日瑞斯食品物料公司；葡萄糖：西王药业有限公司；MRS 固体培养基：杭州微生物试剂有限公司；营养肉汤：青岛高科技园海博科技有限公司；氢氧化钠、酚酞、氯化钠。

菌种：植物乳杆菌：广州绿辉生物科技有限公司；短乳杆菌；干酪乳杆菌：山东中科嘉亿生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004 分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DHG-9076A 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏试验设备有限公司；YLD-6000 生化培养箱：江苏定坛市宏华仪器厂；YX-280D 手提式压力蒸汽灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限责任公司；SW-CJ-2F 无菌操作台：苏州安泰空气技术有限公司；MJBL25B3 美的搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；精密移液枪、无菌试管、无菌锥形瓶。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂的筛选 将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌设定不同的菌间配比进行发酵，如表1所示。

表1 乳酸菌菌间配比Table1 Lactic acid bacteria ratio

将3 株乳酸菌单独及复配发酵，按4%（V/V 菌种活菌数约为 108 cfu/mL）的接种量接种于羊栖菜浆中，30 ℃发酵60 h，每隔12 h 测定酸度、活菌数，根据羊栖菜发酵期间指标变化，确定乳酸菌发酵羊栖菜的最适菌间配比。

1.3.2 工艺流程 鲜羊栖菜→挑选→清洗→沥干→打浆→加入脱脂乳粉与葡萄糖→121℃高压灭菌15 min →冷却→接种→恒温培养

1.3.3 发酵条件的确定 （1）葡萄糖添加量对乳酸菌发酵羊栖菜浆的影响：按照乳酸菌发酵羊栖菜浆的工艺流程，脱脂乳添加量为3%，发酵剂接种量为4%，发酵温度为30 ℃，分别添加2%、4%、6%、8%、10%的葡萄糖进行恒温发酵，每隔12 h 测定发酵浆的乳酸菌菌落总数和总酸含量。

（2）脱脂乳粉添加量对乳酸菌发酵羊栖菜浆的影响：按照乳酸菌发酵羊栖菜浆的工艺流程，葡萄糖添加量为8%，发酵剂接种量为4%，发酵温度为30 ℃，分别添加1%、2%、3%、4%、5%的脱脂乳粉进行恒温发酵，每隔12 h 测定发酵浆的乳酸菌菌落总数和总酸含量。

（3）接种量对乳酸菌发酵羊栖菜浆的影响：按照乳酸菌发酵羊栖菜浆的工艺流程，脱脂乳粉添加量为3%，葡萄糖添加量为8%，发酵温度为30 ℃，按发酵剂接种量1%、2%、3%、4%、5%进行恒温发酵，每隔12 h 测定发酵浆的乳酸菌菌落总数和总酸含量。

（4）发酵温度对乳酸菌发酵羊栖菜浆的影响：按照乳酸菌发酵羊栖菜浆的工艺流程，脱脂乳添加量为3%，葡萄糖添加量为8%，发酵剂接种量为4%，分别置于26、30、34、38、42 ℃下进行恒温发酵，每隔12 h 测定发酵浆的乳酸菌菌落总数和总酸含量。

1.3.4 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，选取具有显著影响的单因素接种量、发酵温度、发酵时间为自变量，菌落总数为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析试验。其因素水平编码表见表2。

表2 Box-Behnken 试验设计的因素和水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.3.5 总酸的测定 参照国标GB/T12456-2008。

1.3.6 菌落总数测定 参照国标GB4789.35-2016。

1.4 数据处理

试验数据用SPSS 软件处理，数据采用平均值±标准差的形式表示，绘图采用Origin8 软件。

2 结果与分析

2.1 不同菌间配比对羊栖菜浆发酵的影响

2.1.1 单菌发酵 3 种乳酸菌分别单独发酵羊栖菜浆产酸与活菌数如图1 所示，从图中可看出，3 种乳酸菌可以很好的在羊栖菜浆中生长。总酸含量变化基本一致，随着时间的增加而增加；3 种乳酸菌的活菌数都是随着时间的增加先增多而后减少，在48 h 达到最大值。其中植物乳杆菌的活菌数略高于其他2 种菌，在发酵48 h 后达到最大值为(12.59 ±0.05) lg (cfu/mL)；干酪乳杆菌与短乳杆菌活菌数差别很小，在48 h 达到最大值，分别为(12.29 ± 0.04)和(12.24 ± 0.02) lg (cfu/mL)。

图1 单菌发酵对羊栖菜浆发酵总酸及菌落总数的影响Fig.1 Effect of single-fermentation fermentation on total acid and total number of total fermentation of Sargassum fusiformis pulp

2.1.2 乳酸菌两两复配发酵 将3 种乳酸菌两两配比发酵羊栖菜浆，其产酸与活菌数如图2 所示。从图中可看出3 种乳酸菌两两配比乳酸菌生长情况优于单菌发酵。其总酸含量都是随着时间的增加而增加，其中5 组配比的酸度要高于其他2 组，呈现较快的上升趋势；活菌数都是随着时间的增加先增多而后减少，第4 组与第6 组活菌数相差无几，都在36 h 达到最大值，分别为(12.23±0.03)和(12.25±0.05) lg(cfu/mL)，第5 组在48 h 达到最大值为(12.59±0.05) lg(cfu/mL)。

图2 菌种两两复配对羊栖菜发酵总酸及菌落总数的影响Fig.2 Effect of strains on the total acid and total number of colonies fermented by Sargassum fusiformis

2.1.3 3 种菌复合配比发酵 将3 种菌复配发酵羊栖菜浆，其产酸与活菌数如图3 所示，从图中可以看出3 种乳酸菌复配发酵所产总酸含量变化趋势基本一致，随着时间的增加而增加；而乳酸菌生长能力则是有很大的差距。将菌间不同配比对羊栖菜浆发酵产酸的影响结果进行方差分析（表3）可知，乳酸菌间不同配比对羊栖菜浆发酵的总酸有显著影响，结合其菌落的生长情况，选取第8 组配比即植物乳杆菌∶干酪乳杆菌∶短乳杆菌=2∶1∶2 进行后续试验。

图3 3 种菌复配对羊栖菜发酵产酸及菌落总数的影响Fig.3 Effect of three kinds of bacteria on the acid production and total number of colonies of Sargassum fusiformis

表3 不同配比对羊栖菜发酵产酸与菌落总数结果的方差分析Table 3 Variance analysis of the results of different acid production and total number of colonies in the fermentation of Sargassum fusiformis

2.2 乳酸菌发酵工艺的单因素试验研究

2.2.1 葡萄糖添加量的影响 由图4 可看出，葡萄糖添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%。随着葡萄糖添加量的增加，总酸含量也随着时间的增加而增加。这是因为在发酵过程中葡萄糖能为乳酸菌生长提供能量，并在发酵过程中消耗掉一部分产生有机酸。葡萄糖添加量对于乳酸菌含量的影响并没有规律性，添加量为4%是总体趋势较好。

图4 葡萄糖添加量对羊栖菜发酵总酸及菌落总数的影响Fig.4 Effect of glucose addition on total acid and total number of colonies fermented by Sargassum fusiforme

2.2.2 脱脂乳粉添加量的影响 如图5 所示，脱脂乳粉添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%。随着脱脂乳粉添加量的增加，总酸含量也随着时间的增加而增加；脱脂乳粉添加量对于活性乳酸菌含量也具有一定的影响。乳粉是乳酸菌发酵中最常见的原料，通过在羊栖菜浆里添加适量乳粉，可以促进乳酸菌的生长和提高活性乳酸菌的含量。但是乳粉添加过量，会掩盖降低了乳酸菌对于羊栖菜的发酵分解作用。所以应选取适量的乳粉添加量，促进乳酸菌的生长和提高活性乳酸菌的含量。由图可知，当脱脂乳粉添加量为3%时，菌落总数最多，乳酸菌生长最好。

图5 脱脂乳粉添加量对羊栖菜发酵产酸与菌落总数的影响Fig.5 Effect of the addition amount of skim milk powder on the acid production and total number of colonies of Sargassum fusiforme

2.2.3 乳酸菌接种量的影响 如图6 所示，乳酸菌接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%。随着接种量的增加，总酸含量也随着时间的增加而增加；由图6 可看出种量过少，发酵速度慢，对底物分解差，产酸少，影响发酵效果，接种量过多，发酵速度过快，产酸过多，在5%是达到最大值；随着乳酸菌接种量的增加，活性乳酸菌的数量也越多，接种量为3%发酵时间为36 h 时达到13.03 lg (cfu/mL)，之后活菌数逐渐下降。

图6 乳酸菌接种量对羊栖菜发酵产酸与菌落总数的影响Fig.6 Effect of inoculating amount of lactic acid bacteria on the acid production and total number of colonies of Sargassum fusiforme

2.2.4 发酵温度的影响 如图7 所示，接种温度分别为26、30、34、38、42 ℃。在不同温度下，乳酸菌发酵羊栖菜浆所产总酸与活菌数也不同。从图中可知，30、34、38 ℃所产总酸相差无几，在较高温度42 ℃时所产总酸最少；在34 ℃下发酵36 h，乳酸菌生长较好，菌落总数可达到13.25 lg (cfu/mL)，随着时间的增加，乳酸菌进入衰退期，含量减少。将上述条件进行方差分析，选取影响效果显著的接种量，发酵温度与发酵时间为因素进行响应面试验。

图7 发酵温度对羊栖菜发酵产酸与菌落总数的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on the acid production and total number of colonies of Sargassum fusiforme

2.3 乳酸菌发酵羊栖菜浆工艺的优化

2.3.1 二次多项式回归模型的建立及显著性分析 Box-Behnken 试验设计方案及结果，如表4 所示，通过Design-Expert 8.0.6 对数据进行回归拟合，得到各因素与响应值（菌落总数）的二次多项式回归方程：Y=12.13-6.250E-0.03A+0.23B-0.28C-0.37AB+0.46AC+1.06BC-0.40A2-0.70B2-0.11C2其中Y为菌落总数，A、B、C分别为接种量、发酵温度与发酵时间。

表4 Box-Behnken 试验设计方案与结果Table 4 Box-Behnken test design and results

为了验证模型的可靠性，对二次多项式回归模型进行方差分析，结果见表模型的F 值为41.32，模型极显著（P＜0.001），说明此模型有意义［17-18］；失拟项P值为 0.554 1，失拟项不显著，通过对试验模型可信度进行分析，得到决定系数R2=0.981 5，响应值的变化有 98.15% 来源于所选因素，表明方程拟合度较好。说明该回归方程很好的描述各试验因素与响应值之间关系，试验方法可靠。对模型进行回归方程系数显著性检验可知：因素B、C 对菌落总数的影响极显著（P＜0.01）、三因素的交互作用均极显著（P＜0.01），二次项A2、B2极显著，C2不显著。

表5 响应面回归方程的方差分析Table 5 Analysis of variance of response surface regression equation

2.3.2 响应面的分析及最佳配比的确定 从图8 ～10 中可以看出，3 个因素对响应值的影响程度大小顺序为发酵温度＞发酵时间＞接种量，所有等高线均为椭圆，因此3 种因素两两间的相互作用均显著（P＜0.01），与方差分析结果一样。

图8 接种量与发酵温度对菌落总数影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour of the influence of inoculum size and fermentation temperature on the total number of colonies

通过Design-Expert 8.0.6 软件对回归模型的分析得出，乳酸菌发酵羊栖菜浆的最优工艺为接种量为2.66%，发酵时间为29.93 h，发酵温度为30 ℃，此时菌落总数预测值为12.592 5 lg (cfu/mL)。

图9 接种量与发酵温度对菌落总数影响的响应面和等高线Fig.9 Response surface and contour of the effect of inoculum size and fermentation temperature on the total number of colonies

图10 发酵时间与发酵温度对菌落总数影响的响应面及等高线Fig.10 Response surface and contour of the interaction of various factors on the total number of colonies

3 结论

通过单因素试验，对影响乳酸菌数的因素—葡萄糖添加量、脱脂乳粉添加量、接种量、发酵温度分别进行考察，通过方差分析结果显示，接种量、发酵时间、发酵温度对试验结果影响极显著，葡萄糖添加量和脱脂乳粉添加量对试验结果影响不显著。

通过响应面分析，得到乳酸菌发酵羊栖菜浆的最优工艺为接种量为2.66%，发酵时间为29.93 h，发酵温度为30 ℃，此时菌落总数预测值为12.592 5 lg (cfu/mL)。相对比肖欣欣利用植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌3 株乳酸菌发酵海带［19］，以及颜玉虾利用海带进行乳酸菌发酵咀嚼片的研制［16］，上述工艺发酵的发酵液酸度高，乳酸菌活菌数较好。这为获得优质乳酸菌扩大了来源，也为制备不同种类的乳酸菌发酵剂提供了选择。

本试验利用乳酸菌对羊栖菜浆进行发酵。通过将羊栖菜打浆后接种混合乳酸菌发酵剂进行发酵，促进了羊栖菜营养成分和生物活性物质的溶出，获得了高含量的活性乳酸菌，实现了将羊栖菜营养功效和乳酸菌活性功效结合的效果，提高了羊栖菜的利用率，拓宽了羊栖菜精深加工的途径。