无创产前检测技术在胎儿染色体拷贝数变异中的应用

谭玲珑 黄婷婷 黎俏 邹永毅 刘艳秋

江西省妇幼保健院医学遗传中心，江西省出生缺陷防治管理中心，江西省出生缺陷防控重点实验室（南昌 330006）

据统计，我国新生儿出生缺陷发生率约为5.6%，随着出生人口的增加及孕妇高龄化，缺陷出生儿的病例总数也在逐年上升，其中染色体异常是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一。目前临床上应用广泛的无创产前检测（non-invasive prenatal test，NIPT）技术可以在产前筛查出染色体异常胎儿，对降低出生缺陷率有很大的帮助。NIPT 是通过抽取母体外周血，对孕妇血浆中胎儿游离DNA 进行高通量测序的技术，用于筛查胎儿21 三体、18 三体、13 三体综合征的临床价值已得到肯定，可较好避免部分异常胎儿的出生［1］。随着NIPT技术的发展，临床上NIPT可筛查出其他染色体的非整倍体变异及拷贝数变异（copy number variations，CNVs）［2］，当NIPT 提示胎儿CNVs 时建议行羊膜腔穿刺术和染色体分析进一步明确诊断。最常用的方法主要是染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA），CMA 技术可以检测全基因组水平染色体拷贝数变异［3］，还可检测嵌合体、杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）及部分单亲二倍体（uniparental disomy，UPD）等，较传统染色体核型分析可额外发现6%～15%的染色体微小变异［4］。本研究通过对NIPT 提示胎儿染色体拷贝数变异的孕妇行羊膜腔穿刺术，提取羊水细胞同时行染色体核型分析及CMA 验证NIPT 结果［5］，以确定染色体是否异常及异常片段大小，从而探讨NIPT 在胎儿染色体拷贝数变异中的应用价值，并评估NIPT 筛查染色体微缺失、微重复的准确性。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019 年1 月至2021 年1 月在江西省妇幼保健院产前诊断中心就诊，因NIPT 结果提示除21、18、13 号染色体及性染色体异常外其他染色体拷贝数变异的样本114 例，均行羊膜腔穿刺手术，孕妇年龄20～43 岁，妊娠周数18～24 周，术前均签署产前诊断知情同意书，明确手术流程、手术风险及染色体核型分析技术、CMA技术的意义、局限性。所有标本同时进行染色体核型分析和CMA 分析。根据检测结果，部分夫妇行外周血染色体核型分析及CMA，与胎儿结果进行比对。最后对所有孕妇妊娠结局进行随访登记。

1.2 方法

1.2.1 NIPT 检测孕妇签署知情同意书后，采集外周血5 mL，分离血浆，按照SOP 操作要求提取游离DNA 后进行文库构建和上机测序，最后进行DNA 检测与数据分析。数据结果判断用Z 值来表示，Z 值在-3.0～3.0 表示低风险结果，Z 值≥3 提示高风险建议行羊膜腔穿刺术进一步诊断。

1.2.2 羊膜腔穿刺术所有孕妇签署手术知情同意书，行无菌消毒，于18～28 周在B 超引导下行羊膜腔穿刺术，术中对胎儿、胎盘进行定位，避开损伤胎儿、胎盘的位置进针，无菌抽取30 mL 羊水，其中20 mL 羊水进行细胞培养，10 mL 羊水进行CMA 检测。

1.2.3 染色体核型分析羊水细胞培养后，收细胞，制片，G 显带。每例标本计数20 个中期分裂象，分析5 个核型，当发现嵌合体或异常核型时，加倍计数细胞数目。核型命名根据人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2016）标准。

1.2.4 染色体微阵列分析采用美国Affy-metrix公司750K 芯片试剂盒及美国Clontech 公司DNA扩增试剂盒，NspI 酶随机消化DNA 为短片段，连接补齐消化后产物末端，PCR 扩增，利用磁珠法纯化、片段化，将产物标记，与芯片杂交后洗片、染色，扫描获取数据。并进一步采用Chas v4 软件进行分析及结果判读。

2 结果

2.1 NIPT 结果本研究选取的114 个病例中，NIPT 提示胎儿拷贝数缺失45 例，拷贝数重复65例，拷贝数缺失合并重复4 例。染色体缺失、重复片段大小方面，CNVs ＞10 Mb 77 例（67.54%），CNVs ≤10 Mb 37例（32.46%）。见表1。

表1 NIPT 筛查染色体缺失、重复的片段大小Tab.1 Segment size of chromosome deletion and duplication screened by NIPT例

2.2 羊水细胞染色体核型分析结果在114例行羊水细胞染色体核型分析病例中，确诊异常17 例，异常检出率为14.9%（17/114）。其中，染色体核型分析结果与CMA 结果比较，另检出3 例异常，1 例（例24）为染色体复杂平衡易位；1 例（例23）核型47，XN，+9［4］/46，XN［59］为低比例嵌合；1 例（例25）为21 号染色体随体延长考虑多态性。见表2～5。

表2 胎儿染色体核型分析和CMA 均为异常结果比较Tab.2 Chromosome karyotype analysis and CMA were abnormal results

表3 胎儿染色体核型分析异常结果和CMA 正常结果比较Tab.3 Comparison of abnormal results of fetal chromosome karyotype analysis and normal results of CMA

表4 胎儿CMA 意义不明结果分析Tab.4 Analysis of fetal CMA with unknown significance

表5 胎儿染色体核型分析正常结果和CMA 异常结果比较Tab.5 Comparison of normal results of fetal chromosome karyotype analysis and abnormal results of CMA

2.3 羊水细胞CMA 检测结果114 例NIPT 提示染色体拷贝数变异的孕妇，CMA 检测确诊异常34 例，符合率29.82%（34/114），其中致病性变异21 例，可能致病变异1 例，意义不明确变异12 例，见表2～5。

2.4 后期随访结果对114 例行产前诊断孕妇进行了随访，21 例CMA 结果提示致病性变异，其中19 例夫妻双方经知情同意后选择了引产，2 例已正常出生，家长代述均生长发育正常；1 例CMA 结果提示为可能致病变异胎儿已正常出生；12 例CMA 结果提示为临床意义不明确变异，其中2 例胎儿已引产，8 例胎儿已出生，家长代诉孩子体检均未见异常，2 例正常妊娠中，四维彩超、后期超声均未提示异常；1 例CMA 结果提示正常而染色体核型结果提示平衡易位携带者已正常出生；1 例CMA 结果提示正常而染色体核型结果提示9 号染色体低比例嵌合最终选择引产；1 例CMA 结果提示正常而染色体核型结果提示21 号染色体随体延长已正常出生。其他77 例CMA 检测结果正常胎儿目前未发现其他异常。

2.5 遗传性胎儿染色体片段缺失或重复CMA提示胎儿染色体缺失或重复的病例中，有7 例明确来源，分别遗传自母亲或为新发突变，见表6。

表6 遗传性胎儿染色体片段缺失或重复Tab.6 Hereditable fetal chromosomal fragment deletion or duplication

3 讨论

染色体微缺失微重复是除染色体非整倍体外的一类常见的染色体异常，是导致新生儿出生缺陷的原因之一［6-7］，有研究［8］显示CNVs 导致的微缺失、微重复综合征占所有新生儿先天性异常的1%～2%。目前临床上应用广泛的NIPT 技术在产前筛查胎儿的常见染色体异常（如21 三体、18 三体、13 三体综合征等）时有较高的准确性。随着NIPT技术的发展，越来越多的研究［9］发现NIPT 也可筛查出其他染色体的非整倍体变异及CNVs。

羊水细胞染色体核型分析是胎儿染色体异常诊断的金标准［10］。染色体核型分析可以检测染色体数目异常、大的结构异常、平衡易位、低比例嵌合等，但由于技术的局限性，仅能发现＞10 Mb 的染色体异常［11］，运用高分辨率显带技术可以检出4～5 Mb 以上的染色体异常［12］。本研究中检出17例染色体核型异常与NIPT 结果相符，其中1 例胎儿为复杂平衡易位携带者、1 例胎儿9 号染色体低比例嵌合（6.3%）而CMA 结果提示正常、1 例提示胎儿21 号染色体随体延长考虑多态性。

CMA 技术可以检测全基因组CNVs，还可检测嵌合体、杂合性缺失及部分单亲二倍体等［13］，对于NIPT 提示胎儿CNVs，建议行染色体核型分析联合应用CMA，以提高染色体异常检出率［14］。本研究中，114例NIPT 提示染色体拷贝数变异的孕妇行产前诊断，CMA 检测确诊异常34 例（29.82%），与姜楠、吴莉等［15-16］的数据报道较为一致。本研究中，经CMA 诊断34 例异常中，29 例与NIPT 筛查结果基本一致，阳性符合率为85.3%（29/34），仅5 例不一致。NIPT 筛查染色体缺失、重复的片段大小比较，可以发现染色体片段越大，检出率越高，有文章报道CNV ≥5 Mb 时，NIPT 检出率达到90.9%，CNV ≤5 Mb 时，NIPT检出率仅有14.3%［17］。分析染色体片段较小未被检出，考虑可能与胎儿游离DNA浓度过低、胎盘限制性嵌合、测序深度不够、测序数据量不足等因素有关［18］。CMA 34 例异常结果中检出临床意义不明确变异12 例，针对致病性不确定CNVs 病例，临床上建议夫妇双方抽血行CMA 与胎儿结果比对。本研究7对夫妇行CMA对照，其中6 例胎儿拷贝数变异与其母亲一致（5 例已正常出生，1 例正常妊娠中），1 例为新发突变（选择终止妊娠）。据此，可以考虑胎儿拷贝数不确定变异大多是遗传自双亲，考虑临床表现正常，但由于本研究夫妇比对样本量较少，仍需进一步验证［19］。

本研究对114 例行产前诊断孕妇进行了随访，21 例CMA 结果提示致病性变异，其中19 例夫妻双方经知情同意后选择了引产，2 例经临床咨询现已出生，1 例22 号染色体q11.21 区段有2.83 Mb片段重复，夫妇CMA 比对结果显示胎儿母亲携带22q11.21 重 复；另1 例Xp22.31 有1.68 Mb 片 段 缺失，夫妇CMA 比对结果显示胎儿母亲携带Xp22.31缺失，经临床咨询告知女性存在X 染色体失活，但男性异常X 染色体出现临床表型。对12 例CMA结果提示临床意义不明随访，8 例出生，2 例正常妊娠中，2 例胎儿终止妊娠，其中1 例11 号染色体q21q22.1 区段有6.41Mb 片段缺失，夫妇行CMA 比对，双方结果均正常，临床咨询告知可能风险，最终选择终止妊娠。其他77 例CMA 检测结果正常胎儿目前已出生60 例，17 例正常妊娠中，均未发现其他异常。

综上所述，NIPT 是一项无创伤、无流产、无感染、准确率高、检出率高并广泛应用于临床的新技术。随着胎儿拷贝数变异检出率的不断提高，染色体异常胎儿也随之被检出，因此，NIPT 对CNVs具有一定的预测价值。同时，对于NIPT 提示胎儿染色体微缺失、微重复，专家建议行产前诊断联合应用染色体核型分析及CMA 检测技术以明确诊断，根据结果必要时行夫妇双方染色体核型分析或CMA 比对，为临床遗传咨询提供意见及依据。NIPT 检测存在假阳性结果，这样也导致了一部分不必要的产前诊断及增加了胎儿流产、感染等风险，故临床应用需谨慎。总之，NIPT 具有广泛的临床应用价值同时该检测方法需要不断优化。