3D聚合酶突变对肠道病毒A组71型复制影响的研究

朱 颖,翁育伟

肠道病毒A组71型(Enterovirus71,EV-A71)是引起手足口病的主要病原体,属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。EV-A71基因组为单股正链RNA分子,全长约7.4 kb左右,编码4个结构蛋白(VP1～4)以及7个非结构蛋白[1]。在病毒非结构蛋白中,3D聚合酶(3D polymerase,3Dpol)主要参与病毒复制[1],同时也参与一些炎症小体活化、激活炎症反应[2],因此3DPol突变可能影响病毒的复制能力从而导致致病力的差异。在体外,3DPol的突变主要影响病毒增殖和温度敏感性等生物学特征的改变。既往我们比较中国大陆地区EV-A71 C4a和C4b两个进化分支、以及轻重症患者中EV-A71的3DPol发现,EV-A71病毒第16位、256位上氨基酸分布差异具有统计学意义[3-4],为观察上述两个氨基酸突变对病毒复制和温度敏感性的影响,本研究选取1株野生型EV-A71分离株作为亲本,利用反向遗传学技术构建病毒感染性克隆,并在其3DPol中分别引入N16S和I256V突变,经转录和转染RD细胞后,获得体外拯救的病毒亲本株及突变株,用于探究上述两个突变对病毒体外增殖和温度敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 毒株和细胞 EV-A71野生株EV-A71/QZ1040系从福建省一例重症手足口患儿咽拭子标本中分离获得。RD细胞来源于中国疾病预防控制中心,由本中心传代保存。

1.2 主 要 试 剂 GXL DNA Polymerase购 自Ta KaRa公司,SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis Super Mix、LipofectamineTMMessenger-MAXTMReagent购 自Invitrogen公 司、Ribo-MAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7购自Promega公司;QIAquick Gel Extraction Kit、RNeasy Mini kit购 自QIAGEN公 司;EV-A71单克隆抗体65 H12由厦门大学实验室惠赠,FITC标记的二抗购自abcam公司;FastMutagenesis System购自Transgen公司;DAPI购自碧云天公司。病毒基因组扩增及3Dpol区突变所用引物序列见表1。其中在基因组扩增上下游引物中分别引入T7启动子位点和poly T(30)。

表1 EV-A71基因组扩增及突变使用的引物Tab.1 The primers designed for genomic amplification and point mutation

1.3 病毒基因组扩增及感染性克隆构建 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂说明提取病毒RNA(v RNA)。以EV-A71-R为反转录引物,按照SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis Super Mix使用说明合成第一链cDNA。使用引物EV-A71-F/R’和GXL DNA Polymerase和扩增病毒基因组DNA(gDNA),反应条件为:94℃5 min,94℃20 s,55℃20 s,72℃5 min,循 环40次,72℃延 伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后,插入TOPOXL2-PCR载体,转化One ShotTMOmni MAXTM2 T1RChemically CompetentE.coliCells挑取克隆并提取质粒,使用M13F/R测定病毒全基因组序列,鉴定无误后命名为p TOPO-XL2-QZ1040,保存－80℃保存备用。

1.4 3Dpol区定点突变 以p TOPO-XL2-QZ1040序列为模板,设计突变引物mut 16NS F/R和mut 256IV F/R。按FastMutagenesis System说明书对p TOPO-XL2-QZ1040质粒进行点突变。反应条件 如 下94℃5 min,94℃20 s,55℃20 s,72℃5 min,循环25次,72℃延伸10 min。产物纯化后转化DMT Chemically Competent Cell,提取质粒,含3Dpol区N16S、I256V突变的质粒经测序证实后分别命名为p TOPO-XL2-QZ1040N16S、p TOPO-XL2-QZ1040I256V。

1.5 感染性克隆的体外转录与病毒拯救 分别以p TOPO-XL2-QZ1040、p TOPO-XL2-QZ1040N16S、p TOPO-XL2-QZ1040I256V为模板,使用引物EVA71-F/R’,PCR扩增获得EV-A71/QZ1040,EVA71/QZ1040N16S,EV-A71/QZ1040I256V全长gDNA。电泳回收纯化后,使用Ribo MAXTMLarge Scale RNA Production Systems-T7将其体外转录为病毒基因组RNA(rvRNA)并测定浓度。RD细胞接种24孔板(1×105cell/孔),生长至70%～80%单层,后按LipofectamineTMMessenger MAXTMReagent说明将rv RNA(500 ng/孔)转染细胞。培养5 d后收获上清,继续传代两次,待细胞病变后冻融3次后,4℃、12 000 rpm离心10 min,收 集 上清分装后－80℃备用。

1.6 病毒滴度测定 96孔培养板中加入RD细胞悬液100μL(2×105cell),待细胞长至单层,将病毒液10倍系列稀释后,加入96孔板(100μL/孔),每个稀释度4孔。36.5℃培养7 d,每日观察细胞病变。使用Behrens-Kärber公式计算病毒滴度[6]。重复测定3次,取其平均值。

1.7 病毒的免疫荧光鉴定 用病毒液接种单层RD细胞,36 h后无菌PBS洗3次,4%多聚甲醛固定20 min,0.5% Triton-X 100室温作用20 min,PBS浸洗3次后滴加1% BSA,室温封闭30 min,65 H12m Ab(1∶2 000;稀释在PBS)4℃孵育过夜,加FITC标记二抗孵育37℃1 h,DAPI(1∶10 000)孵育5 min,荧光显微镜下观察。

1.8 病毒体外增殖试验 向24孔板中接种1×105个细胞,24 h后接种病毒(MOI＝0.01),每株接种3孔,36.5℃,5%CO2孵育60 min,吸弃病毒液,PBS洗涤1次后添加1 m L细胞维持液继续培养,于接种后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后收获样本。按1.6方法测定病毒液滴度并绘制增殖动力学曲线。另取上述各时间点样本200μL,提取病毒核酸。以系列稀释的已知浓度RNA作标准品同步扩增,根据不同时间点样本中核酸Ct值计算其RNA含量[5]。采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析,P＜0.05差异有统计学意义。

1.9 病毒温度敏感性试验 将病毒(MOI＝0.01)接种RD细胞,每株接种3孔,在39.5℃条件下吸附60 min后吸出病毒液,PBS清洗一次以后添加1 m L维持液进行培养,于接种后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h收获样本。按1.6方法绘制增殖动力学曲线,样本中RNA含量按照1.8方法定量及统计分析。

2 结 果

2.1 亲本与突变病毒感染性克隆3Dpol区序列测定

质粒衍生的亲本病毒EV-A71/FJQZ1040及两株突变病毒EV-A71/QZ1040N16S、EV-A71/QZ1040I256V的3Dpol区进行测序,结果显示,与EV-A71/QZ1040株相比,EV-A71/QZ1040N16S、EV-A71/QZ1040I256V的3Dpol第16、256位密码子分别产生AAC→AGC和ATA→GTA突变,上述突变将导致3Dpol分别产生N16S和I256V氨基酸替代,与预期结果一致。核苷酸序列差异见图1。

图1 3Dpol点突变的核苷酸测序鉴定Fig.1 Identification of point mutations introduced into 3Dpol by nucleotide sequencing

2.2 病毒拯救 体外转录的野生型EV-A71/QZ1040(简称亲本株)及EV-A71/QZ1040N16S(简称N16S突 变 株)、EV-A71/QZ1040I256V(简 称I256V突变株)病毒rvRNA转 染RD细 胞,72 h左右可以观察到典型细胞病变(图2,B～D),冻融后收取上清液感染RD细胞,利用EV-A71 VP1单克隆抗体进行免疫荧光检测,3株病毒感染的细胞均可检出病毒VP1抗原(图2,F～H),说明3株病毒均被成功拯救,具有感染性。

图2 病毒拯救及感染性鉴定Fig.2 Identification of infectivity of the rescued viruses

2.3 病毒体外增殖试验 结果显示,3株病毒(MOI＝0.01)接种RD细胞后,病毒滴度随培养时间逐步上升。如图3A所示,3株病毒TCID50在72～96 h达到峰值,至96 h时亲本株、N16S和I256V突变株滴度分别为5.875±0.22、5.625±0.13、5.625±0.13 log TCID50/100μL。病毒RNA定量检测结果显示,尽管感染后48 h,亲本株RNA含量低于两突变株,但96 h时,三株病毒RNA含量分别为1.53±0.07、1.15±0.36、(1.18±0.11)×108copies/μL,其无差异统计学意义(图3B)。

图3 拯救病毒的体外增殖试验Fig.3 Proliferation test of rescued viruses on RD cell

2.4 温度敏感性试验 病毒滴度测定结果显示,在39.5℃的条件下,3株病毒滴度均增殖缓慢,至感染后96 h,亲本株、N16S和I256V突变株的滴度分别为3.75±0.22、2.5±0.22、0.75±0.25 log TCID50/100μL,低 于36.5℃条 件 下 的 病 毒 滴 度(P＜0.01),其中I256V突变株滴度基本无增长,提示3株病毒均对高温敏感。病毒RNA含量检测结果显示在此条件下,亲本株和N16S突变株病毒RNA含量呈增长趋势,但I256V突变株RNA含量一直维持在较低水平。48～72 h时I256V突变株与亲本

株及N16S突变株的RNA含量具有差异,96 h时各组病毒RNA拷贝数亲本株＞N16S突变株＞I256V突变株,亲本株与其它两株突变株RNA含量具有差异,提示N16S和1256V突变可能使毒株对温度更加敏感。

图4 温度敏感性试验Fig.4 Temperature sensitivity test

3 讨 论

本研究采用PCR扩增的方法从质粒中扩增EV-A71全长片段,经体外转录后转染RD细胞获得了具有感染性的病毒,测序结果表明突变可稳定传代,为进一步研究3Dpol突变对病毒增殖的影响提供了重要基础。36.5℃条件下的病毒体外增殖曲线显示,尽管N16S突变株在体外增殖早期(48～72 h),其滴度增长较亲本株和I256V突变株慢,但在达到平台期后,3株病毒滴度没有差异,因此正常生长条件下上述两个突变对病毒复制能力无影响。结合病毒RNA含量测定的结果,48 h时亲本株病毒RNA含量较两突变株低,可能系病毒突变株产生更多无感染性非成熟病毒颗粒所导致。在高温条件下(39.5℃),亲本株与突变株滴度增长和病毒RNA含量相较于36.5℃培养条件下病毒增殖速度变慢,N16S和I256V突变可能在高温下抑制了病毒的复制和增殖,虽然3株病毒都表现出温度敏感的特征,但两突变株的受高温抑制作用比亲本株更明显,其中I256V突变株对高温的耐受性差,提示这两个突变可能降低病毒在高温下的复制能力。

小RNA病毒3Dpol是一类RNA依赖的RNA聚合酶[7],其关键位点的突变可能对病毒的生物学特征产生重要影响。例如,在脊灰病毒(Poliovirus,PV)中,T362I突变导致病毒复制错配,在小鼠模型中表现为毒力减弱[8];在EV-A71中,向复制子系统和感染性克隆引入3D区I251T突变后,病毒在39.5℃条件下复制能力降低,与小鼠模型实验结果类似[9];G64R/T和S264L突变可使EV-A71病毒具有利巴韦林抗性的同时且保持3Dpol的高保真表型,而高保真表型毒株被认为病毒毒力减弱[10-11]。本研究结果表明,3Dpol的N16S和I256V突变不影响病毒正常条件下复制增殖但可能抑制病毒在高温条件下的复制,因此这两个突变可能降低了病毒的毒性,但该位点突变与病毒毒力是否有关尚有待进一步研究。

既往研究表明,EV-A71毒力的遗传机制复杂,影响病毒毒力的位点可分布在整个基因组,多表现多位点联合作用:通过强弱毒株嵌合研究发现,置换后高毒力表型株的复制能力下降[12-13];编码区与非编码区某些位点联合突变也能导致毒株毒力改变[14]。建立病毒拯救系统是研究病毒变异与生物学特征的常用方法,病毒拯救的效率以及观察结果可能受引入的报告基因、poly A长度[15]、聚合酶种类[16]以及不同的拯救方法[17]等影响,本研究采用体外转录RNA直接转染的方法获得拯救病毒,方法简单且病毒遗传特征稳定,为体外研究病毒变异和生物学特征提供了方法基础。但本研究的观察结果仅为体外实验,尚未在动物模型内观察其生物学特征,因此研究结果尚需进一步确认。

利益冲突:无

引用本文格式:朱颖,翁育伟.3D聚合酶突变对肠道病毒A组71型复制影响的研究[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1078-1083.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.163