云南省泸西县啮齿动物携带立克次体调查

袁庆虹,杨利圭,田 杰,杨卫红,周济华,杨向东,于彬彬,罗德荣,杨 蛟

啮齿动物是多种病原体的自然界宿主,其中许多鼠类携带的病原体可引起人类严重疾病。立克次体在自然界中广泛存在,他们大多在啮齿动物宿主和传播媒介之间循环,人被携带立克次体的节肢动物如螨、蜱叮咬而感染[1]。恙虫病(Tsutsugamushi disease)又名丛林斑疹伤寒(Scrub typhus),是由恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)引起的一种自然疫源性疾病。临床上以发热、焦痂、淋巴结肿大为特征[2],在云南的广大农村发病率较高。在我国,黄胸鼠、褐家鼠、黄毛鼠、黑线姬鼠等啮齿动物为恙虫病东方体的主要宿主[3-5]。无形体(Anaplasmaspp.)和埃立克体(Ehrlichiaspp.)主要以哺乳类、啮齿类和有蹄动物为宿主,经蜱传播,引起人类和动物的无形体病和埃立克体病,如人单核细胞埃立克体病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)和人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasma,HGA)[6]。

泸西县为云南省红河哈尼族彝族自治州下辖县,气候温和,动植物资源丰富,病原的动物宿主和媒介生物种类也很多。该县是流行性出血热的自然疫源地,也是国家级的出血热监测点[7],但尚不清楚该地区啮齿动物的立克次体感染状况。本研究在泸西县捕鼠,对其脾样本进行PCR检测,血清进行抗体检测,旨在了解恙虫病东方体、无形体和埃立克体在当地自然界的存在状况,为其所致疾病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 啮齿动物标本采集 2015年8月至2017年9月在云南省泸西县居民区和野外山坡地采用鼠笼和鼠夹捕鼠。捕获的鼠经形态学鉴定并登记后,解剖取鼠脾脏器,液氮冻存待检。其中活鼠解剖前取股动脉血,分离血清待检。

1.2 DNA提取和特异性基因检测 取适量脾组织,放入乳钵内研磨,加入无菌蒸馏水制成混悬液。根据天根DNA提取试剂盒说明书的操作方法提取样本DNA。

采用巢氏PCR方法检测恙虫病东方体groEL基因,无形体和埃立克体16SrRNA基因片段。根据参考文献[8-9]合成相关引物,引物由上海生工合成(表1)。

表1 立克次体检测用引物Tab.1 Primers for detection of Rickettsia

恙虫病东方体groEL基因检测时,第一轮 PCR采用立克次体科通用外引物Gro-1和Gro-2,PCR反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,45℃退火40 s,72℃延伸40 s,共39个循环,最后72℃4 min,产物为616 bp。第二轮PCR为恙虫病内引物TF1和TR2,反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变 性35 s,56℃退 火35 s,72℃延 伸35 s,共39个循环,最后72℃4 min,产生217 bp大小的条带。无形体和埃立克体16S r RNA检测时第一轮PCR采用无形体科通用外引物Eh-out1和Eh-out2,PCR反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,55℃退火50 s,72℃延伸60 s,共40个循环,最后72℃5 min,产物为653 bp。第二轮PCR分别为无形体内引物HGA1和HGA2,埃立克体内引物HME1和HME2,反应条件同第一轮,均产生389 bp大小的条带。取PCR产物5μL,用含Goldview染料的1.0%的琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪观察结果。

1.3 PCR阳性产物的DNA序列测定及遗传进化分析 将扩增的阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。通过NCBI网站,利用“BLAST”工具,将测得序列与Gen Bank中注册的DNA序列进行同源性比较;使用MEGA7.0软件邻接法Neighbour-joining(NJ)构建系统进化树,进行系统进化分析。

1.4 鼠血清恙虫病IgG抗体检测 采用间接免疫荧光试验(IFA)检测鼠血清中东方体IgG抗体,在荧光显微镜观察结果。在阳性和阴性对照均成立的情况下,根据特异性荧光的强弱来判定结果,以≥1∶20为阳性。

2 结 果

2.1 捕获啮齿动物种群构成 在泸西县野外共计放置1 960个笼和夹次,捕获鼠155只。居民区共计放置1 600个笼和夹次,捕获鼠70只。其中野外以大绒鼠50.97%(79/155)、中华姬鼠20.0%(31/155)和黄胸鼠16.77%(26/155)为优势鼠种;居民区以黄胸鼠85.71%(60/70)为优势鼠种。黄胸鼠在野外和居民区均占比较高(表2)。

表2 泸西县啮齿动物种群构成Tab.2 Composition of rodent population in LUXI County

2.2 恙虫病、无形体及埃立克体巢氏PCR检测结果 对225只鼠脾脏样本进行恙虫病东方体groEL基因和无形体与埃立克体16S r RNA基因巢式PCR检测,5只鼠样本检测到恙虫病东方体groEL基因(364 bp),分别命名为LUXI10、LUXI11、LUXI13、LUXI34和LUXI164,其中2份来自黄胸鼠(2.41%,2/83)和3份 来 自 大 绒 鼠(3.80%,3/79)。另外3份鼠样本检出16S r RNA基因(389 bp),其中1份来自大绒鼠(LUXI150),2份来源黄胸鼠(LUXI189和LUXI134)。

2.3 鼠血清恙虫病东方体IgG抗体检测结果IFA检测鼠血清中恙虫病东方体IgG抗体,从85份鼠血清中检出阳性7份(8.24%)。其中黄胸鼠3份,2份来自野外捕获鼠,1份来自居民区捕获鼠;大绒鼠阳性3份;中华姬鼠阳性1份(表3)。

表3 IFA法检测鼠血清恙虫病东方体抗体结果Tab.3 Detection of Oriental tsutsugamushi antibody in rat serum by IFA

2.4 恙虫病东方体groEL基因同源性及系统进化分析 将扩增得的5份恙虫病东方体groEL基因片段测序,获得基因序列LUXI11、LUXI13和LUXI34的相似性为100%,其与另外2个序列LUXI10和LUXI164的 相 似 性 为99.02%～99.68%。通过与GenBank中收录的部分恙虫病东方体相应基因片段序列进行同源性比较,发现本次阳性样本基因序列与日本姬鼠菌株(KC688332)、中国安徽省羊菌株(GQ499935)和泰国东方体菌株(EF551292)序列相似性为98.75%～100%。系统进化分析显示,本次检出恙虫病东方体菌株与来自日本的kato血清型株(KC688332)、泰国的UT76血清型株(EF551292)、中国安徽的东方体(GQ499935)共处于同一分支,与印度病人分离株(MG601959)、日本病人Shimokoshi血清型株(JX188395)、北京病人分离株(JQ894502)和云南鼠源株(KY987155)的亲缘关系较远(图1)。

图1 基于东方体groEL基因部分序列构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on groEL sequences of Orientia

2.5 埃立克体16SrRNA基因同源性及进化分析3份16SrRNA基因阳性标本中,1份来自大绒鼠序列(LUXI150)的菌株与来自美国伊文氏埃立克体(KJ942217)和查菲埃立克体(CP007479)、中国辽宁埃立克体(EU179240)和北京查菲埃立克体(GQ499971)、巴西埃立克体(JQ260846)基因片段的序列同源性为99.71%～100%。选取不同埃立克体属中的代表株,采用边缘无形体(A.marginale)HM538192株作为外群,与本次LUXI150株构建系统进化树,结果该株与美国伊文氏埃立克体(KJ942217)、中国辽宁的埃立克体(EU179240)和巴西埃立克体(JQ260846)处于同一分支,而与2株犬埃立克体(GU810149和KJ513194)、2株鼠埃立克体(CP006917和AB196302)、2反刍动物埃立克体(DQ647616和CR767821)相距较远(图2)。

图2 基于埃立克体16S rRNA基因部分序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of Ehrlichia

经序列比较,16SrRNA基因序列(LUXI134)属于巴尔通体;LUXI189属于沃尔巴克体,与来自中国新疆羊皮蝇(KY224163)、南非(MF461469)、巴西(KF249460)和法国(JQ888305)的沃尔巴克氏体基因片段的序列同源性为97.93%～98.22%。

3 讨 论

立克次体病是一类严重威胁人类健康的自然疫源性疾病,在世界范围内呈散发和季节性流行。对人致病的立克次体种类多,目前发现有20多种立克次体可对人致病,包括立克次体科中的立克次体属、东方体属,无形体科的无形体属、埃里克体属等。立克次体病原体还在不断被发现[10]。我国几乎存在世界上发现的所有立克次体病,恙虫病尤其普遍[11]。立克次体病原体大多以啮齿动物为宿主,以节肢动物为媒介进行传播,因而开展野生动物携带立克次体病原的研究,从宿主动物源头阻止立克次体病的流行,是预防和控制疾病的有效手段。

我国啮齿类动物有近200种,已经查明近80种为病原宿主[12-13]。云南省气候温和,温度适宜,动物宿主和媒介生物异常丰富,各种自然疫源性疾病高发。此次调查发现,泸西地区啮齿动物中的优势种为绒鼠属、姬鼠属和黄胸鼠。而黄胸鼠是同时活动于居民区和野外的鼠种。对225只鼠脾脏标本进行巢式PCR检测,5只鼠检出恙虫病东方体,其中2只为黄胸鼠和3只为大绒鼠,另外1只大绒鼠检出埃立克体,2只黄胸鼠分别检出巴尔通体和沃尔巴克体。这几种鼠体内均检测到恙虫病东方体抗体。检出结果表明该地区存在多种立克次体感染的混合自然疫源地,黄胸鼠为该地区最主要的病原宿主,其能够把自然疫源地病原体带到人类活动较密集的农耕区和居民区。恙虫病是云南分布最广的立克次体病,发病率一直居高不下,且时有暴发流行[14-17],本次研究结果是黄胸鼠和大绒鼠为恙虫病东方体主要宿主,其携带的病原体有聚集现象,有引起暴发流行的可能。

埃立克体在自然界中以脊椎动物和哺乳动物为宿主,以节肢动物硬蜱为传播媒介。宿主动物包括犬科动物、啮齿动物、鹿、牛、羊等野生或家养动物[18-19]。云南曾在硬蜱以及鼠类标本中检测到查菲埃立克体[20]。本次在啮齿动物中检测到埃立克体,该株与分离自美国的伊文氏埃立克体(KJ942217)关系最近,与中国辽宁的埃立克体(EU179240)和巴西埃立克体(JQ260846)也处于同一分支。伊氏埃立克体主要侵袭犬粒细胞,由伊氏埃立克体引起的犬埃立克体病多发生于美洲钝眼蜱密度高的美国中南部,引起的人埃立克体病症状与人单核细胞埃立克体病症状基本相同。

啮齿动物是无形体的主要储存宿主。既往资料显示,云南的啮齿动物和犬中存在无形体感染[21-22]。本次未在啮齿动物中检测到无形体,但是从1份黄胸鼠样本检出沃尔巴克体,其在节肢动物体内广泛存在。既往研究表明,沃尔巴克体主要存在于蚊虫、白蚁、蝇等节肢动物和昆虫体内,约40%的节肢动物和65%的昆虫自然携带沃尔巴克体[23-24]。目前对于啮齿动物感染沃尔巴克氏体的研究很少,本研究是首次报道在鼠类中检测到沃尔巴克体。

巴尔通体隶属于根瘤菌目(Rhizobiales)下的巴尔通体科(Bartonellaceae)巴尔通体属(Bartonella)。多种巴通体能够感染人,如汉赛氏巴尔通体(Bartonellahenselae)引起猫抓病(Cat-scratch disease,CSD)、五日热巴尔通体(Bartonellaquintana)引起战壕热(Trench fever)、杆状巴尔通体引起卡里翁氏病、伊丽莎白巴尔通体(Bartonellaelizabethae)引起心内膜炎等。本次用无形体16S r RNA基因PCR扩出1个阳性片段,经测序分析后意外发现其属于巴尔通体,与此前黎浩等和李伶俐等分别对恒河猴和小型兽进行无形体PCR检测时,意外检测到巴尔通体的结果一致[25-26]。

本研究证实泸西地区为恙虫病的自然疫源地,且少数啮齿动物还携带埃立克体、巴尔通体或沃尔巴克体,这些病原菌可能感染人,需注意防控。降低环境中鼠类、恙螨、蜱、蚤的密度是控制立克次体感染的重要措施,野外作业时做好个人防护也是预防立克次体感染的有效手段。

利益冲突:无

引用本文格式:袁庆虹,杨利圭,田杰,等.云南省泸西县啮齿动物携带立克次体调查[J].中国人兽共患病学报,2021,37(12):1141-1146.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.151