基于表型性状的核桃品种区分研究

赵 灿，莫 琰，刘传菊，豁银强，张 倩，杨 莹，汤尚文,*

（1.湖北文理学院，湖北 襄阳 441053；2.襄阳市农业科学院，湖北 襄阳 441057；3.襄阳市公共检验检测中心，湖北 襄阳 441104）

核桃属胡桃科胡桃属，为世界著名的四大坚果之一，在我国有着悠久的栽培历史，是我国重要的栽培经济树种[1]。核桃营养价值丰富，其加工品如干核桃、炒核桃（仁）、核桃油和核桃粉等广受消费者青睐。经自然演变和人工培育，目前我国核桃种质资源十分丰富，已有记载的无性系优良品种（系）216 个，农家实生良种164 个，优良单株（系）486 个[2]。虽然在研究人员长期实践下，我国已筛选出一批核桃优良新品种，如温185、鲁香、绿岭和香玲等，但各核桃产区因成本、管理等原因，核桃品种混杂、良莠不齐[3]。

从加工角度来看，不同品种核桃的加工适宜性差别很大，有些品种油脂含量高，适宜于加工核桃油；有些品种蛋白含量高，适宜于加工核桃蛋白饮料；有些核桃香味突出、口感酥脆，适宜于干制鲜食。如何准确识别核桃品种、确定其加工适宜性以指导原料采购，是众多中小核桃加工企业面临的首要问题。有众多研究人员采用分子标记[4-6]、光谱法[7-8]、同位素法[9]、元素分析法[10]、X 射线[11]、营养成分分析[12]和表型性状[13]等方法研究核桃种质资源和产地的鉴定、分类。但DNA分子标记等方法对于试验平台和技术人员水平要求较高，普通加工企业难以具体操作。

众多方法中通过表型性状鉴定核桃品种是较为简单易行的一种方法[13]，其通过简单的测量和对外观的观察即可初步鉴定核桃品种。我国分别于2011 年和2016 年先后出台了GB/T 26909—2011[14]《植物新品种特异性、一致性、稳定性测试指南 核桃属》和NY/T 2935—2016[15]《核桃种质资源描述规范》，两份文件均以表型性状为主要指标给出了核桃种质资源描述的方法，其对于核桃种质的鉴定具有指导性的作用。但两份标准中均有大量指标需要通过研究人员的主观观察进行确定，例如坚果形状、缝合线、核壳沟纹、核壳刻窝、取仁难易程度等，这些指标的判定会由于观察人员的经验和主观性产生较大的差异。

鉴于上述问题，本文拟从核桃表观性状中挑选一批能够客观测量的指标，结合主成分分析法和聚类分析法研究不同品种核桃的差异，建立基于表型性状的核桃品种区分方法，以期为核桃加工厂提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

试验测试核桃均由襄阳金康园农业发展有限公司提供，其中绿岭核桃（LL）由公司在保康收购，温185 核桃（W）、新新2 号（XX）采购于新疆，大泡核桃（DP）采购于云南，绵核桃（M）采购于山西。脂肪和蛋白质测定所用试剂和药品均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

K1100 全自动凯氏定氮仪和SOX406 索氏提取仪，山东海能科学仪器有限公司；MS-70 快速水分测定仪，日本AND 公司；OXITEST 油脂氧化测定仪，意大利VELP 公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃形态数据采集

1.2.1.1 单果质量、果仁质量和出仁率

参照NY/T 2935—2016[15]采用称重计算核桃坚果的单果质量、果仁质量和出仁率。不同样品随机选取10 个坚果，手工去壳取出核桃仁，称核桃单果质量和果仁质量，并计算出仁率。

出仁率（%）=m1/m2×100式中：m1为果仁质量，g；m2为核桃单果质量，g。

1.2.1.2 核桃单果3 径测量

参照文献[16]的方法，各样品随机选取10 个坚果，使用游标卡尺，按图1 所示量取核桃3 径。核桃坚果中部胴部之间的距离记为侧径D1，核桃坚果中部缝合线之间的距离记为横径D2，核桃坚果顶部与底部之间的距离记为纵径H，侧径、横径、纵径的3 径平均值为A。以上单位均为mm。

图1 核桃测量示意图Fig.1 Schematic diagram of walnut measurement

1.2.2 测定项目与方法

水分含量：参照GB 5009.3—2016[17]中第一法（直接干燥法）规定的内容进行测定。

脂肪含量：参照GB 5009.6—2016[18]中第一法（索氏抽提法）规定的内容进行测定。

蛋白质含量：参照GB 5009.5—2016[19]中第一法（凯式定氮法）规定的内容进行测定。

由于单个核桃仁质量在6～10 g 的样品量较少，水分、蛋白、脂肪检测时将多个核桃仁混合后进行检测，脂肪和蛋白质含量测定后折算成干物质含量表示，单位为g/100 g 干物质。

1.2.3 核桃氧化诱导期测试

核桃去壳后研磨混合均匀称取10 g 样品，放入样品盘平铺后密封，向样品仓充入纯氧至氧压为600 kPa，测试温度设置为90 ℃。每种核桃平行测试3 次。

1.2.4 数据处理

数据采用Origin 2018 计算及进行显著性分析，表示方法为±s；主成分分析和聚类分析采用Origin 2018（Principal Component Analysis 插件和Heat Map with Dendrogram 插件）进行分析并绘图。

2 结果与分析

2.1 核桃外观形貌分析

图2 为供试5 种核桃的外观形貌。根据NY/T2935—2016[15]中所述方法，对5 种核桃表型差异进行观察并描述。DP 核桃在外观上与其他4 种有明显不同，核桃坚果形状为方圆形，截面呈椭圆形，果顶有明显凹陷，核桃仁呈圆形；颜色较深，果形较小；表面核壳沟纹密集，核壳刻窝较深。W、LL、XX 和M 核桃在果实表型上较为接近，但亦有细微差别。XX 核桃果顶较平，M核桃坚果形状为长椭圆形，W 核桃相对LL、XX 和M3 核壳沟纹密集且核壳刻窝较深。根据核桃果实表型形状对核桃进行分类和鉴定虽然简便易行，但受观察人员主观判断因素影响较大，不同观察人员对同一核桃果实外观表型的观察结果很可能各不相同。

图2 五种核桃外观形貌Fig.2 The appearance morphology of five kinds of walnuts

2.2 核桃表型及成分分析

为方便在加工前对核桃品种进行准确辨识，对5 种核桃的D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2和m1/m2共10 项表型数据以及蛋白质和脂肪含量进行了测量和计算，结果见表1。

表1 核桃表型及成分数据Table 1 Phenotype and composition data of walnuts

表1 中表型数据均为单个核桃的测量和计算数据。由表1 可以看出，DP 核桃的3 径平均值A、横径D2和纵径H 均显著低于其他品种（P＜0.05）；W 和LL核桃的侧径D1、3 径平均值A 和单果质量m2相近，均显著高于其他3 个品种（P＜0.05）；W 核桃的横径D2、横纵径比D2/H、果仁质量m1和出仁率m1/m2以及LL核桃的纵径H 显著高于其他品种（P＜0.05）；W 核桃脂肪含量显著低于其他品种（P＜0.05），LL 核桃的脂肪以及蛋白含量较高。从商品属性上来说，较大的单果尺寸和出仁率有利于核桃的销售[20-21]，蛋白和脂肪含量较高也意味着营养价值高，因此W 核桃和LL 更适合于作为商品化品种。

2.3 核桃表型数据的主成分分析（PCA）

核桃的表型性状数据通过简单的测量取和称量即可获得，操作简单易行。对5 种核桃的10 项表型数据进行采集和计算后，采用主成分分析法（PCA）和系统聚类分析法对所得数据进行分析（核桃脂肪和蛋白含量未纳入PCA 和聚类分析基础数据，主要由于这两种统计方法要求由同一样品完成所有测试指标数据采集，相互间才有可比较性，但单个核桃仁质量仅为6～10 g，样品质量达不到重复检测3 次的要求），以期能通过简单的表型数据对核桃进行分类和鉴定，结果见表2～4 及图3～4。

PCA 分析法可将原来有一定相关的指标重新组合成一组相互无关的综合指标来明确度量各个指标的重要性[22]，以找出核桃表型分类的主要贡献因子。从表2 可知，前3 个主成分因子提取特征值均大于1[23]，且累计方差贡献率达到93.079%，能够覆盖试验样本的大部分表型信息。因此确定提取前3 个主成分因子进行进一步的分析。

表2 核桃表型数据评价因子特征值和累计方差贡献率Table 2 Evaluation factor eigenvalues and cumulative variance contribution rates of walnuts phenotypic data

由表3 可知，D2、A 和m1等指标在第1 主成分（PC1）上有较高的载荷（一般认为因子载荷绝对值大于0.5 表明该变量对提取的主成分有较大贡献，下同），说明第1 主成分主要涵盖与核桃尺寸和质量相关的信息，可将其归纳为核桃大小信息（贡献率为53.712 7%）；D1/H 和D2/H 在第2 主成分（PC2）上有较高的载荷，因D1/H 和D2/H 均为计算数据，从数据意义上可反映出核桃纵向剖面的形状，因此可将其归纳为核桃纵向形状信息（贡献率为26.866 7%）；D1/D2在第3 主成分（PC3）上有较高的载荷，D1/D2可反映出核桃横向截面的形状，可将其归纳为核桃横向形状信息（贡献率为12.499 4%）。

表3 核桃表型数据初始因子载荷和特征向量Table 3 Initial factor loads and eigenvectors of walnuts phenotypic data

将D1、D2、H、D1/D2、D1/H、D2/H、A、m1、m2和m1/m2共10 个指标原始数据经标准化后分别用X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10表示，经主成分分析建立核桃表型信息模型，得到如下线性关系式，式中F1、F2和F3表示3 个主成分的得分值，F 为综合得分，各主成分系数由表2 中特征值计算得出。

根据表3 推测，F1（核桃大小）正向取值越大，核桃尺寸越大，核桃仁质量越大；F2（核桃纵向形状）正向取值越大，核桃纵向剖面越趋向于圆形，取值越小，果形越长；F3（核桃横向形状）正向取值越大，核桃横向剖面越趋向于椭圆形，取值越小，截面越圆。

提取PC1、PC2、PC3 主成分绘制主成分得分图，如图3 所示。从图3 可以看出，W 核桃在PC1 正向取值上分布较多，说明W 核桃尺寸大、核桃仁质量大；DP 核桃在PC1 负向取值上分布较多，说明DP 核桃尺寸小、核桃仁质量小；W 核桃在PC2 正向取值和PC3 负向取值上分布较多，说明W 核桃形状呈圆球形；DP 核桃在PC2 正向取值和PC3 正向取值上分布较多，说明DP 核桃形状呈扁椭圆形；LL 核桃在PC3正向取值上分布较多，XX 核桃在PC2 负向取值和PC3 负向取值上分布较多，M 核桃在PC2 负向取值上分布较多，说明LL、XX 和M 3 种核桃形状呈长椭圆形。从图3 亦可看出，图中椭圆形区域为不同品种核桃表型数据PCA 因子的95%置信区间，图中各椭圆区域均有交集，说明未能完全分离不同品种。由上可知，仅靠核桃表型数据很难将不同品种完全分离。

图3 核桃表型数据主成分得分图Fig.3 Principal component scores of walnuts phenotypic data

按上述模型分别计算提取3 个主成分的得分及综合得分，结果见表4。F1、F2和F3得分最高的分别为W、W/DP 和LL 核桃，综合得分F 最高的为W 核桃，其次为LL 核桃。说明，W 和LL 核桃从表型数据上看具有更好的商品属性。

表4 核桃表型数据主成分综合得分及排序Table 4 Comprehensive scores and ranking of principal components in walnuts phenotypic data

2.4 核桃表型数据的系统聚类分析

对5 种核桃本的10 项表型数据标准化转换后进行系统聚类分析，聚类方法采用平均法，距离类型采用欧氏距离，聚类热图如图4 所示。图中颜色由绿到红表示指标值由低到高，颜色越红代表指标值越高，颜色越绿代表指标值越低。

图4 核桃表型数据系统聚类分析图Fig.4 Systematic cluster analysis diagrams of walnuts phenotypic data

由图4 可以看出，在欧氏距离为3.309 2～4.295 2时，可将50 个样本分为4 类（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），每类分别含5、10、28 和7 个样本；在欧氏距离为4.295 2～4.863 5 时，可分为3 类（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ），每类分别含5、10 和35 个样本；在欧氏距离大于4.863 5 时，可分为2 类（Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ），每类分别含5 和45 个样本。但无论欧氏距离如何取值划分，DP 核桃在表型数据聚类中均可自成一类，与其他4 种核桃在表型上有显著性差异，其他品种核桃单果样本聚类分析结果相互混杂，无法有效区分。且D1/D2和D1/H 两个指标在DP核桃上显著高于其他品种，这两个指标较高代表DP核桃在外型上趋近于扁椭圆形。

对于10 个表型数据指标，在欧氏距离为6.129 7～8.132 8 时，可将指标分为3 类（Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#）；在欧氏距离＞8.132 8 时，可将指标分为2 类（Ⅰ#、Ⅱ#+Ⅲ#）。其中Ⅰ#可解释为核桃大小信息，Ⅲ#可解释为核桃形状信息，这与前述PCA 分析结果类似。但Ⅱ#中形状（D2/H）和质量信息（m1/m2）均存在，单独作为一类指标进行分析较为牵强，可将10 个指标按Ⅰ#和Ⅱ#+Ⅲ#两类进行分类，Ⅰ#代表核桃大小信息，Ⅱ#+Ⅲ#代表核桃形状信息。

2.5 核桃的氧化曲线及氧化诱导期

干制核桃水分降低至安全水分含量之下时即可长期贮藏[24]，但由于核桃油脂含量丰富，在较长的贮藏期内会逐渐被氧化，影响其食用品质。采用油脂氧化测定仪绘制不同品种核桃的加速氧化曲线，同时推算其氧化诱导期。氧化诱导期从侧面反映了核桃的耐贮藏性，诱导期越长说明其贮藏性越好[25]。图5 为核桃的加速氧化曲线和5 种核桃的氧化诱导期，图中Y1和Y2的交点对应的时间即为氧化诱导期。氧化曲线分为两个阶段：Ⅰ阶段在测试开始至诱导期这段时间内，油脂缓慢吸收氧气形成过氧化物；Ⅱ阶段从诱导期时间点开始，油脂迅速吸收氧气，过氧化物形成的同时由于高温的影响迅速分解[26]。从图中可以看出DP 核桃诱导期显著大于其他4 种核桃（P＜0.05），其次为W、XX 和LL/M 核桃。

图5 核桃的加速氧化曲线（A）和5 种核桃的氧化诱导期（B）Fig.5 Accelerated oxidation curves of walnuts and oxidation induction periods of five kinds of walnuts

2.6 表型、成分和氧化诱导期综合聚类分析

以D1、D2、H、A、D1/D2、D1/H、D2/H、m1、m2、m1/m2、脂肪、蛋白质和氧化诱导期共13 项指标的平均值为基础数据，进一步采用聚类分析法直观地反映不同核桃指标间的差异，结果见图6。

由图6 可以看出，DP 核桃在D1/D2、D1/H、氧化诱导期和脂肪共4 项指标上显著高于其他品种，在D2、A 和H 共3 项指标上显著低于其他品种；W 核桃在D2、m1、D2/H 和m1/m2共4 项指标上显著高于其他品种，在脂肪指标上显著低于其他品种；LL 和XX 核桃在蛋白质指标上显著高于其他品种；XX 核桃在D1和D1/H 共2 项指标上显著低于其他品种；M 核桃在蛋白质含量上显著低于其他品种。

图6 核桃的聚类热图Fig.6 Clustering heat maps of walnuts

在欧氏距离小于2.805 1 时，5 种核桃可以很好地被区分；欧氏距离在2.805 1～3.338 3 时，5 种核桃被分为4 类，其中M 和XX 核桃被归为一类；欧氏距离在3.338 3～5.122 5 时，核桃被分为3 类，其中M、XX 和LL 核桃被归为一类；欧氏距离大于5.122 5时，除DP 核桃外，其他核桃归为一类。说明表型（尺寸、质量、成分）和氧化特性指标相结合可有效区分不同品种的核桃。

所有检测指标在欧式距离大于2.812 4 时被分为两类。D1、D2、H、A、D2/H、m1、m2、m1/m2和蛋白质共9 个指标被分为一类，这类指标主要和核桃大小及蛋白质含量有关；D1/D2、D1/H、脂肪和氧化诱导期共4 个指标被分为一类，这类指标主要和核桃形状及脂肪含量、组成（脂肪组成与氧化诱导期相关）有关。

3 结论

（1）采用核桃表型数据对核桃品种进行区分，其操作简便易行，经PCA 分析，结果表明：采用主成分得分图无法直观有效地区分核桃品种，但采用主成分综合评分法可对不同品种核桃的商品属性进行评分和排序，5 种核桃中W 和LL 核桃具有较好的商品属性。

（2）将表型（尺寸、质量、成分）和氧化特性指标相结合，采用系统聚类分析，通过聚类热图可直观反映不同品种核桃的指标差异，能有效区分不同品种核桃。

（3）采用PCA 和系统聚类法区分不同品种核桃时，数据的采集以单个核桃为基本单元进行采集，尺寸和质量等数据采集较为简单，但水分、脂肪、蛋白质和氧化诱导期等数据采集需要较多的样品量，单个核桃仁不能满足检测量的需求。后续研究中可采用随机抽样方法扩大样本数量，将不同品种的核桃随机分为多份，每一份进行数据采集取平均值后再进行统计分析。