助剂激健在防治棉花黄萎病中的效果

赖成霞，玛依拉·玉素音，石必显，李春平，姜梦竹，郑子漂，杨 栋

(1.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学科学技术学院，乌鲁木齐 830052；3.新疆维吾尔自治区植物保护站，乌鲁木齐 830049)

0 引 言

【研究意义】棉花黃萎病是危害棉花产量和品质的重要障碍性因素，由于其致病菌大丽轮枝菌存在多种形式的初侵染源，并且具有变异快等特点，造成培育抗病品种、使用化学药剂和利用新的栽培技术等方法防病效果均不理想。筛选出高效抗病的植物诱抗剂、杀菌剂与助剂激健的组方及合理的施用措施，对棉花黃萎病防治中化学农药的减量增效具有重要的意义。【前人研究进展】棉花黄萎病(cottonVerticilliumwilt)是由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)[1]侵染而发生的一种土传维管束真菌病害，是新疆棉区危害最为严重的病害之一，该病原菌不仅能侵染棉花，而且还能侵染茄子、番茄、土豆等多个物种[2]，茄黄萎病初侵染源实验表明，土壤、植物病残体、种子中的微菌核以及厚垣孢子和休眠菌丝均可成为该病的初侵染源[3,4]，而在棉花中，微菌核是该病在土壤中的主要结构及初侵染源，是棉花黃萎病发病的主要原因，其侵染过程产生的菌丝或孢子，进入棉花的维管系统，大量菌丝和孢子的繁殖刺激邻近薄壁细胞产生胶状物或侵填体堵塞导管，导致水分和养分运输困难，使植株发生萎蔫、黄化等。并且该病可通过多种途径进行传播和重复侵染，如羊粪[5]，棉花种子外被的短绒、植物病残体及土壤[6]。前期研究者将多个药物进行有效复配可有效防治棉花黄萎病，如奇农素与多菌灵进行种子脱毒处理后用60%3911和卫福包衣剂包衣,再利用奇农素和多菌灵、农用链霉素、硫酸铜混合液进行灌根和叶面喷施处理可有效防控棉花黄萎病[7]；多菌灵与芽孢菌“B908”混用防治棉花黃萎病，效果大于单用多菌灵[8]；随着科研水平的长足发展，提高棉花自身的防御体系的诱抗剂也成为棉花黃萎病防治的有效措施之一，如3%氨基寡糖素寡糖，在棉花黄萎病发病初期进行叶面喷雾,能有效防治棉花黃萎病，防效高达54%[9]。【本研究切入点】大丽轮枝菌不仅变异速度快而且微菌核具有较强的抵御逆境的能力，防治困难。从培育抗病品种、单一使用化学药剂和生物防治技术等多个方面入手，但防病效果均不理想，以提高药物的利用率，有效抑制病原菌萌发及生长，提高植物自身免疫系统的综合防治策略成为研究的热点，在生产中，菌/药组合、药/药以及植物诱抗剂组合在棉花黃萎病防治上均起到了重要作用，但其化学农药的施用也对环境安全造成影响，但当黄萎病病原菌侵入植株体内后，化学药剂、生物制剂能进入植物体内的含量很低，仍需加大施药剂量才能将病害防治在经济阈值以下。筛选出能增加植物体内有效农药含量但又不加大实际农药施用剂量的增效剂，则成为棉花黄萎病药剂减施增效的一个有效措施。【拟解决的关键问题】通过将化学农药多菌灵、乙蒜素，生物菌剂枯草芽孢杆菌，增效剂激健进行优化组合配方，并对黄萎病致病菌V991菌丝进行菌丝生长速率实验，筛选出激健对V991菌丝显著增效的杀菌剂，采用盆栽黄萎病试验，研究诱抗剂、药/激健的施用措施和施用方法，为新疆棉花黄萎病防治中化学农药的减施增效提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌

棉花黃萎病病原菌-大丽轮枝菌V991(VerticilliumdaliaeKleb)由华中农业大学植物学院朱龙富课题组提供。

1.1.2 棉花品种

供试棉花品种为冀棉11，由河南省农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.3 供试药剂

63%激健可溶性助剂，成都激健生物科技有限公司；50%多菌灵可湿性粉剂，威海韩孚生化药业有限公司；80%乙蒜素乳油，海南正业中农高科股份有限公司；20.02亿/mL枯草芽孢杆菌液体，威远生化；5%氨基寡糖素水剂，海南正业中农高科股份有限公司；PDA培养基(Oxoid公司)。

1.2 方 法

1.2.1 培养基配制

培养棉花黃萎病菌丝、孢子的固体培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基，培养大量孢子的液体培养基-查氏(Czapek)培养基，PDA培养基按照生产商提供的方法配制，即1 L水中加入39 g PDA干粉，煮沸完全溶解后，121℃高压灭菌15 min，再倒板；查氏(Czapek)培养基：1 L水中加入葡萄糖30 g，NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，完全溶解后，121℃高压灭菌15 min。

1.2.2 棉花黄萎病病原菌株的分离培养

供试使用的大丽轮枝菌V991是以孢子的形式储存在-80℃冰箱中，为确保实验的准确性，将病原菌进行活化分离，利用毛细管制成接种针划板，分离获得病原菌单个孢子，由单个孢子产生分离出菌丝型、菌核型及孢子型的病原菌，菌丝型的病原菌株用于进行杀菌剂的毒力测定实验，孢子型的病原菌株用于盆栽防治效果实验。

1.2.3 棉花黄萎病病原菌株致病力的鉴定

选用孢子型的大丽轮枝菌进行致病力测定，先将该菌在25℃下在PDA平板上培养 10～14 d培养，在菌落边缘区域，用直径5 mm的无菌打孔器制成菌饼备用，将2叶期的棉花，用70%的乙醇消毒1 min后，在叶背面用消毒针针刺叶面20下，再将菌饼面朝下放置在针刺部位，对照采用无菌的菌饼进行处理，所有试验均在含有滤纸的无菌培养皿中进行，温度25℃，弱光培养，10 d后观察病斑大小。

1.2.4 病原菌接种液制备

选取鉴定到的强致病力的孢子型大丽轮枝菌在PDA (Potato dextrose agar，PDA)培养基上25℃下培养 7～10 d，在菌落边缘区域，用直径5 mm 无菌打孔器将其菌落制成菌饼，将 4片菌饼加到盛有200 mL Czapek培养基的三角瓶(500 mL)中，在25℃、160 r/min条件下振荡培养5 d。然后过400目钢筛，常温，10 000 g离心5 min，将获得的沉淀加入纯净水，制得病原菌分生孢子悬浮液，应用血球计数板检测其中病原菌分生孢子含量,并用将分生孢子的含量稀释为 107mL/L的悬浮液，作为病原菌接种液。

1.2.5 病原菌接种

当棉苗生长到 2～3 片真叶时，采用伤根共培养的接种方式进行病原菌接种。 将棉苗自营养钵中取出，用无菌剪刀在距根尖 1.5 cm处剪断棉根，再放回原来的营养钵,保持土壤湿度为100%，再接入20 mL 107孢子悬浮液,将接入20 mL的纯净水作为健康对照，每个处理重复3次，每个重复10株苗。

1.2.6 棉苗准备及栽培

选取健康、饱满的棉花种子，用70%乙醇处理1 min，再用15%过氧化氢消毒处理3～4 h，最后用去离子水冲洗3～4遍，在28℃下催芽24 h至种子露白，植入穴盘，土壤中蛭石与营养土的比例为2∶1， pH值6.3，放入温室中生长，温度28℃，光/暗周期14 h/10 h，待子叶完全展开后将苗移栽至营养钵中，至苗生长至三叶期用于盆栽黄萎病防治试验，将温度在25℃左右，始终保持棉苗在低温高湿的条件生长。苗生长期所用的水均为去离子水。

1.2.7 杀菌剂/助剂的抑菌效果测定

采用生长速率法测定3种单一杀菌剂及3种杀菌剂/助剂组合对大丽轮枝菌V991菌丝的抑制作用。采用双因素试验设计，因素1为6种药剂及组合，因素2为药剂浓度，多菌灵设置5个浓度，分别为20、50、66.7、100、200 mg/kg，乙蒜素设置5个浓度，分别为2.5、5、10、20、50 mg/kg，枯草芽孢杆菌设置为2个浓度，分别为5、10 mg/kg，在PDA培养基中分别添加不同浓度的6种杀菌剂混合制成含药培养基平板，以添加等量无菌水的 PDA培养基为对照，各3次重复。用打孔器在供试菌株菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，将其接种到含药平板中央，25℃恒温培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径(mm)，取其平均值，计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率。

抑菌率=[对照菌直径-处理菌落)/(对照菌落直径-5)]×100%。

将药剂浓度换算成浓度对数(x)，菌丝生长抑制率换算成抑制机率值(y)，计算各药剂的抑制中浓度EC50。

1.2.8 不同药/助剂组合对大丽轮枝菌V991的盆栽棉花黄萎病防治效果

设置多菌灵浓度为50 mg/kg，乙蒜素浓度为5 mg/kg，助剂激健浓度为33 mg/kg，诱抗剂氨基寡糖素浓度为20 mg/kg，诱抗剂的施药方法设置为施药后接种和先接种后施药2种方式，第1次施药分别在接种病原菌前24 h和接种后24 h进行；同时设置不同的药/药/助剂/诱抗剂组合，组合1为多菌灵/激健-乙蒜素/激健，组合2为乙蒜素/激健-多菌灵/激健，组合3为多菌灵-乙蒜素，组合4为乙蒜素-多菌灵，上述组合的施药方式为分次依序施药，并设置喷施等量清水作为空白对照。在棉花叶片长至2～3叶期，进行根部接菌，其他不同药剂组合在对照叶片显示病症起进行喷药处理，共喷施2次药，在喷施第1种药后第3 d开始喷施第2种药，使用手动喷雾器施药，以叶面均匀喷施药剂至刚好有药液滴下为标准。第1次病情调查在接种后14 d进行，第2次调查在第2次施药后28 d进行，共调查2次。采用全株调查法进行统计，分别记载病叶数及其病级，计算每个处理的病情指数及防治效果。

1.2.9 病情指标

每次施药前调查棉花黄萎病的病情指数，调查时以株为单位，采用全面调查法，对所有处理的棉花的叶片进行调查，病害分级标准为0级：供试棉花全株无病，叶片无病斑；1级：供试棉花叶片病斑面积占整个叶面积的5%及以下视为一级；3级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的6%～11%视为三级；5级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的13%～21%视为五级；7级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的22%～41%视为七级；9级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的42%～61%视为九级；11级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的62%～81%视为十一级；13级：供试棉花叶片病斑面积占整株叶面积的82%及以上视为十三级。计算病情指数和防治效果。

病情指数=Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高级值)×100。

防治效果=[1-(对照区施药前病情指数×处理区施药后病情指数)] /(对照区施药后病情指数×处理区施药前病情指数)×100。

1.3 数据处理

数据整理、分析运用Excel 2010，插图绘制运用Photoshop 2017。

2 结果与分析

2.1 大丽轮枝菌V991的分离及致病力鉴定

研究表明，共分离到了菌丝型、孢子型以及菌核型3种类型的大丽轮枝菌株，这3种菌落在PDA平板上均为圆形，其中菌丝型、孢子型的菌落边缘整齐，菌丝为白色，菌核型菌落内部黑化，边缘白色但不规则，菌丝型的菌落菌丝较为长且茂密，而孢子型的菌落菌丝短且其上长有大量分生孢子，显微镜观测菌丝型菌落的菌丝形态呈轮枝状，孢子型菌落的分生孢子呈长椭圆形，无色，尽管孢子型菌落的菌丝颜色、外形都比较整齐，但其分生孢子的形态、大小还具有差异，对孢子型的菌株又进行了进一步分离，共获得12个菌株，采用刺伤接种法将含有各菌株的菌饼回接到二叶期的棉花叶片上，以无菌的PDA菌饼为对照，10 d后各菌落均可产生病斑，其中2号菌落N2,7号菌落N7产生的病斑与对照相比明显重，并且N2的病斑面积明显大于N7的病斑面积，菌株N2的致病力明显高于其他菌株。图1

图1 大丽轮枝菌V991的分离及对棉花叶片致病力鉴定Fig.1 Isolation of Vercillium dahliae V991 and identification of the pathogenicity on the cotton leaves

2.2 不同助剂对大丽轮枝菌菌丝生长的影响

研究表明，在自来水，纯净水以及超纯水配制形成的PDA平板上，各处理菌丝均生长良好，并且各处理中菌丝直径无明显差异，而由不同浓度助剂激健配制的PDA平板上，各处理菌丝生长却均存在较大差异，在无药PDA培养皿(CK)中的菌丝形态与含有激健3 000倍液、4 000倍液的PDA培养皿相比，大丽轮枝菌V991菌丝形态正常，而含有激健1 000倍液培养皿中的菌丝则呈现明显的发育不良，菌丝直径降低的情况，激健4 000、3 000、2 000倍液对菌丝的发育虽然也有一定的影响，但这3个处理对菌丝直径的影响无明显差异，不论任何来源的水，均对大丽轮枝菌菌丝的生长无影响，而激健4 000、3 000、2 000、1 000倍液均对菌丝生长具有抑制作用，其中1 000倍液的抑制作用最强。图2

2.3 不同杀菌剂添加助剂后对大丽轮枝菌V991的抑菌效果

研究表明，各杀菌剂添加激健后，大丽轮枝菌的菌丝形态、菌落直径、菌丝颜色均发生了明显变化，其中多菌灵、乙蒜素，随着杀菌剂/激健剂量的不断增加，菌丝直径不断降低，菌丝发育状况也不断降低，菌丝颜色也由最初的白色逐渐变为黄白色，而枯草芽孢杆菌则在添加激健后，其菌丝直径并未减小，相反菌丝形态也呈现不规则状，并且在PDA平板上还有大量杂菌出现，激健并不能充当枯草芽孢杆菌的助剂。添加激健后多菌灵、乙蒜素对菌丝直径的抑制率也显著提高，多菌灵的EC50也由最初的1.707 mg/kg降低至0.104 mg/kg，农药剂量降低了16.4倍，乙蒜素的EC50也由最初的1.249 mg/kg降低至0.824 mg/kg，农药剂量也降低了1.5倍，由此可见，激健可作为多菌灵、乙蒜素的增效剂，可显著提高对大丽轮枝菌V991菌丝的生长速度。图3

图3 大丽轮枝菌V991在不同杀菌剂与杀菌剂/激健处理下的菌落形态及抑菌率Fig.3 Colony morphology and antibacterial rate against Vercillium dahlia V991with different concentrations fungalcide and fungalcide/Jijian treatments

2.4 不同杀菌剂添加激健和氨基寡糖素对棉花黄萎病的盆栽防治效果

研究表明，无论是接菌前还是接菌后施用氨基寡糖素，多菌灵/激健-乙蒜素/激健交替施药组合的防治效果最好，其28 d后的防治效果分别可达69.27%和62.70%，但接种前施用诱抗剂的，其14与28 d的防效相比出现先高后低的情况，而接种后施用诱抗剂的防效情况则与此相反。而其他乙蒜素/激健-多菌灵/激健式，多菌灵-乙蒜素，乙蒜素-多菌灵这3种施药方式对棉花黄萎病V991几乎毫无防治效果，合理的施用杀菌剂与激健的组合是能有效控制黄萎病的发生。表1

注；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

表1 接种病原菌前后24 hr施用诱抗剂对盆栽黄萎病的防治效果Table 1 Control effect of fungicides against potted cotton Vercillium wilt with spraying inducer 24h before or after inoculating pathogen

3 讨 论

药剂防治是棉花黄萎病防治的主要措施之一，如多菌灵[10]，乙蒜素[11]，枯草芽孢杆菌[12-14]，在农田使用中50%的多菌灵使用浓度高达500倍液，并且防治效果也不佳，80%乙蒜素乳油1 500倍液的防效也才达到38.65%，并且为提高药剂对黄萎病的防治效果，采用生物菌与化学农药、植物诱抗剂结合使用的方式，可极大的提高黄萎病的防治效果，如乙蒜素1 500倍液与茉莉酸甲酯50 μg/mL及枯草芽孢杆菌为43.3×105/mL时，防效可达54.25%。

研究综合前人研究结果，以生产中常用的多菌灵、乙蒜素等化学农药为研究对象，利用助剂激健作为增效剂，可显著增加多菌灵、乙蒜素对大丽轮枝菌V991菌丝生长的抑菌率，50 mg/kg多菌灵的抑菌率由原来的19.68%提高至35.49%，5 mg/kg乙蒜素的抑菌率也由原来的14.83%提高至26.29%，并且添加激健后多菌灵的EC50由原来的1.707 mg/kg降低至0.104 mg/kg，其药剂施用量降低了16.41%，乙蒜素添加激健后其EC50也由原来的1.249 mg/kg降低至0.824 mg/kg，药剂施用量也降低了1.52倍，由于不同病原菌的菌株之间对药剂存在敏感性差异现象[15, 16]，并且药剂在不同植物中的也存在渗透和传导性差异，研究在盆栽黄萎病防治实验中采用了交替施药，避免抗性产生的策略，植物诱抗剂与多菌灵/激健-乙蒜素/激健组合对棉花黄萎病有最佳的防治效果，与单因素相比防效有了显著提高，并且无论是接种前还是接种后施用诱抗剂，多菌灵/激健-乙蒜素/激健交替施药组合的防治效果最好，其28 d后的防治效果仍可高达69.27%和62.70%，试验表明，以将植物诱导剂和杀菌剂/激健交替施药防治棉花黄萎病是可行的。但由于试验仅为苗期筛选试验，其施用方式、施用时间、防病机理以及大田防病效果仍需进一步研究。

4 结 论

激健可作多菌灵、乙蒜素的增效剂，可显著增加其对大丽轮枝菌V991菌丝生长的抑制率，但是其对生物菌药枯草芽孢杆菌无效；无论接菌前还是接菌后喷施氨基寡糖素，菌灵/激健-乙蒜素/激健交替施药组合对棉花黄萎病防治效果最佳。