女贞子多糖抗去势小鼠骨质疏松作用研究*

韦秋，侯佳华，覃小燕，杨云，安然，毛浩萍

（天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津 301617）

绝经期骨质疏松是一种以骨量减少和骨微观结构变化导致骨密度降低及骨脆性增加的代谢性骨病[1]，已成为世界上常见的老年疾病之一。破骨细胞为唯一行使骨吸收功能的细胞，在维持骨代谢平衡中发挥重要作用[2]。目前国内外抗骨质疏松的药物以抑制破骨细胞为主[3-4]。女贞子常用于骨质疏松症的治疗[5]，药理研究发现女贞子中的女贞苷、特女贞苷、女贞苷Gl3、油女贞苷、红景天苷、齐墩果酸和熊果酸均具有抗骨质疏松作用[6-7]。但尚未见女贞子多糖对骨质疏松的影响，本研究旨在研究女贞子多糖对去卵巢所致骨质疏松的影响，为女贞子多糖用于骨质疏松症的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠40只，购于北京斯贝福实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2016-0002，动物饲养于中国中医科学院放射医学研究所，饲养温度为20～25℃，湿度为40%～70%，自由进食和饮水。

1.2 药物 女贞子药材1 kg，80%乙醇加热回流提取两次（料液比），每次2 h，药渣挥干乙醇，水提取（90 ℃，2 h，1∶10），提取两次，提取液减压浓缩，乙醇醇沉，调节乙醇终浓度为80%，4℃静置过夜，得沉淀即为女贞子多糖，提取率约为6.4%。结合雌激素片（红利来），新疆新姿源生物制药有限责任公司生产。

1.3 试剂和仪器 无机磷（P）、钙（Ca）全自动生化仪试剂盒，深圳迈瑞生物医疗股份有限公司生产；雌二醇酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，天津安诺瑞康生物技术有限公司；三溴乙醇，Sigma公司；α-MEM培基，Gibico公司；胎牛血清，BioInd公司；抗生素（青霉素、链霉素），BioInd公司；Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution，GE Healthcare公司；巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），R&D systems公司；核因子κB受体活化因子配体（RANKL），R&D systems公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒，碧云天生物技术有限公司；万分之一天平（PTX-FA110S），福州华志科学仪器有限公司生产；全自动生化仪（BS240），深圳迈瑞生物医疗股份有限公司生产；双能射线骨密度仪（UltraFous DXA），FaxitronBioptics；微计算机断层扫描技术（micro CT，VivaCT40），SCANCO Medical AG公司；多功能读板仪（Spark），TECAN公司等。

2 方法

2.1 去势骨质疏松小鼠模型制备 适应性喂养1周后，将小鼠按照随机数字表法随机分为两组其中假手术组8只，造模组32只。腹腔注射1.5%三溴乙醇，每只0.18 mL，造模组进行双侧卵巢摘除术，假手术组摘除双侧卵巢周围脂肪组织，术后连续腹腔注射2万单位青霉素，连续注射3 d。

2.2 分组与给药 造模15 d后眼眶取血约100 μL，假手术组（Sham）和造模组各取8只。随后将32只卵巢摘除小鼠随机分为模型组（OVX），雌激素组（Estrogen，0.039mg/kg）、女贞子多糖3g/kg组（FLLP，3 g/kg）和女贞子多糖 6 g/kg组（FLLP，6 g/kg）。按0.1 mL/10 g灌胃给药，每日1次，连续给药8周，其中假手术组和模型组给对应体积的0.2%羧甲基纤维素钠溶液。每周记录1次小鼠体质量。

2.3 动物取材

2.3.1 股骨及脏器分离 最后1次给药结束后，腹腔注射1.5%三溴乙醇（0.1 mL/10 g），在冰上取出小鼠肝、脾、肾、子宫并称质量，计算脏器指数（以脏器质量/体质量表示）；取小鼠后肢双侧股骨并去除肌肉组织，在4%多聚甲醛中固定。用双能射线骨密度仪扫描分析股骨骨密度，用microCT扫描分析股骨骨微结构。

2.3.2 血浆样本 摘眼球取血，置于提前用肝素钠处理的1.5 mL小型离心管中，静置30 min，1 300×g离心15 min，取血浆分装于200 μL小型离心管中保存。用BS240全自动生化分析仪检测血浆中Ca、P和碱性磷酸酶（ALP）水平。

2.4 骨髓来源单个核细胞分离与破骨细胞诱导分化

2.4.1 骨髓来源单个核细胞分离与纯化 将4周龄C57BL/6J雌鼠脱颈处死并在75%乙醇浸泡5min后，在生物安全柜中分离双侧后肢股骨和胫骨，完全去尽肌肉组织与结缔组织，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）吹出骨髓，用Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution进行密度梯度离心后使用红细胞裂解液裂解红细胞。250×g离心15 min获得单个核细胞。将细胞用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基接种于T25培养瓶中。24 h后，取未贴壁的细胞即可获得纯度较高的骨髓来源单个核细胞。

2.4.2 女贞子多糖对破骨前体细胞活性的影响 将骨髓来源单个核细胞（3×104个/孔）接种到96孔板中，用含25 μg/L MCSF和10%FBS的α-MEN完全培养基培养3 d。随后继续用含25 μg/L MCSF的完全培养基培养，同时给予不同浓度的女贞子多糖（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL）干预培养 5 d，第 3 天时更换培养液。培养结束后吸弃培养基，加入100 μL用α-MEN基培稀释的CCK8溶液，37℃避光孵育2 h，在450 nm处检测吸光度，观察女贞子多糖对破骨前体细胞活性的影响。

2.4.3 女贞子多糖对破骨细胞分化的影响 将骨髓来源单个核细胞（3×104个/孔）接种到96孔板中，用含25 μg/L MCSF和10%FBS的α-MEN完全培养基培养3 d。随后用含25 μg/L MCSF和50 μg/L RANKL的培养液诱导破骨细胞分化。不同浓度的女贞子多糖（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL）干预培养5 d，第3天时更换培养液。诱导培养结束后检测培养上清中TRAP的含量，观察女贞子多糖对破骨细胞分化的影响。

2.5 统计学方法 使用SPSS 24.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 女贞子多糖对体质量、脏器系数的影响 图1A所示，造模15 d后血浆中雌二醇的含量显著降低（P<0.05），提示模型成功建立。给药8周后，与假手术相比，模型组体质量、脾脏指数、肾脏指数、子宫指数均有统计学差异（P<0.05，表1和图1C），肝指数未见统计学差异（P＞0.05，表1）。与模型组相比，雌激素组和女贞子多糖3g/kg组肾系数显著升高（P<0.05，表1）；雌激素组子宫系数显著升高（P<0.05，表1），但女贞子多糖3 g/kg和6 g/kg组多子宫系数均未见统计学差异（P＞0.05，表1）；女贞子多糖不同剂量组体质量和肝系数均未见统计学差异（P＞0.05，表1、图1B和图1C）。

图1 女贞子多糖对去势小鼠体质量的影响（±s）Fig.1 The effect of FLLP on the body weight of ovariectomized mice（±s）

表1 女贞子多糖给药8周对去势小鼠脏器的影响（±s）Tab.1 Effects of FLLP administered for 8 weeks on the organs of ovariectomized mice（±s）

表1 女贞子多糖给药8周对去势小鼠脏器的影响（±s）Tab.1 Effects of FLLP administered for 8 weeks on the organs of ovariectomized mice（±s）

注：Sham：假手术组，OVX：模型组，Estrogen：雌激素组，FLLP：女贞子多糖；与 Sham 相比，#P<0.05；与 OVX 相比，*P<0.05。

组别 肝脏指数 脾脏指数 肾脏指数 子宫指数Sham 0.041 8±0.005 1 0.005 8±0.001 2 0.011 3±0.000 9 0.002 9±0.001 1 OVX 0.041 9±0.003 6 0.004 0±0.000 7# 0.009 9±0.000 6# 0.001 1±0.000 4#Estrogen（0.039 mg/kg） 0.045 6±0.006 0 0.003 4±0.000 4 0.011 2±0.000 4* 0.002 3±0.000 7 3 g/kg FLLP 0.041 0±0.003 9 0.003 5±0.000 3 0.010 7±0.000 8* 0.001 3±0.000 1 6 g/kg FLLP 0.039 5±0.002 0 0.003 7±0.000 6 0.010 4±0.000 7 0.001 3±0.000 6

3.2 女贞子多糖对小鼠股骨骨密度及骨微结构的影响 双能射线结果显示，与假手术组比，给药8周后模型组小鼠股骨骨密度显著降低（P<0.05，图2A）；与模型组比，给雌激素和不同剂量女贞子多糖8周后小鼠股骨骨密度显著升高，具有统计学意义（P<0.05，图2A）。microCT结果显示，与假手术组比，给药8周后模型组小鼠股骨干骺端骨小梁数目（Tb.N）和骨体积分数（BV/TV）显著降低（P<0.05，图2B和图2C），而骨小梁分离度（Tb.Sp）显著升高（P<0.05，图2D）；与模型组相比，3 g/kg和 6 g/kg女贞子多糖组Tb.N显著升高（P<0.05，图2B），3 g/kg女贞子多糖和雌激素组BV/TV显著升高（P<0.05，图2C），3 g/kg和6 g/kg女贞子多糖组Tb.Sp显著降低（P<0.05，图2D）。结果显示3 g/kg和6 g/kg女贞子多糖能明显改善去势所致的骨流失和骨微结构破坏。

图2 女贞子多糖给药8周对去势小鼠股骨骨密度和骨微结构的影响（±s）Fig.2 Effect of FLLP administration for 8 weeks on bone mineral density and bone microstructure of ovariectomized mice（±s）

3.3 女贞子多糖对血浆中Ca、P水平的影响 与假手术组相比，模型组血浆中Ca、P均显著升高（P<0.05，图3A-B）。与模型组相比，雌激素和不同剂量女贞子多糖均能显著降低小鼠血浆中Ca水平（P<0.05，图3A）；6 g/kg女贞子多糖能显著降低小鼠血浆中P的含量（P<0.05，图3B）。

图3 女贞子多糖给药8周对去势小鼠血浆中Ca、P水平的影响（±s）Fig.3 The effect of FLLP administration for 8 weeks on the plasma Ca and P levels in ovariectomized mice（±s）

3.4 女贞子多糖对骨髓来源的单个核细胞向破骨细胞分化的影响 CCK-8 结果显示，1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女贞子多糖对破骨前体细胞活性无显著影响（P＞0.05，图4A）。TRAP结果显示，与对照组相比，模型组的培养上清中TRAP酶活性显著升高（P<0.05，图4B）。与模型组相比，1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女贞子多糖组的培养上清中TRAP酶活性显著降低（P<0.05，图4B）。提示 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL女贞子多糖显著抑制骨髓来源的单个核细胞向破骨细胞分化。

图4 女贞子多糖对骨髓来源的单个核细胞向破骨细胞分化的影响（±s）Fig.4 The effect of FLLP on the differentiation of bone marrow-derived mononuclear cells into osteoclasts（±s）

4 讨论

随着老龄化的加剧，骨质疏松症的患病率逐渐升高。有研究发现骨密度下降分为40～59岁、60～69岁及70岁以上3个年龄段，其中前两个阶段的下降幅度最明显[8]。女性骨质疏松患病率明显高于男性，由于绝经后体内雌激素水平显著下降，对破骨细胞的抑制作用减弱，导致骨密度降低。不同年龄阶段绝经后妇女的骨质疏松症患病率高达21.2%～70.5%[9]。骨质疏松性骨折是其最严重的并发症之一，具有较高的致畸和致残率，严重影响患者生活质量[10-12]。骨质疏松症的防治已成为全球关注和研究的热点之一。中医认为骨质疏松症属于“骨痹”“骨痿”和“骨枯”的范畴，病变在骨，病位在肾，与肝脾胃紧密相关，以补肾填精、健脾和胃和血化瘀为治则[13]。

女贞子具有滋阴补肾的作用，其含有三萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、多糖类、挥发油等成分[14-17]。女贞子在临床上常用于骨质疏松症的治疗，现代药理研究表明女贞子及其成分女贞苷、特女贞苷、齐墩果酸和熊果酸等可通过激活Wnt/β-catenin/LRP6通路，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；抑制NFATC1/RANKL信号通路抑制破骨细胞分化；促进小肠及十二指肠中钙重吸收以及升高骨组织中Ca和P的含量，调控骨代谢等多种途径发挥抗骨质疏松作用[7，18-21]。但是女贞子多糖对骨质疏松的作用未见相关报道。战兴晓等[22]研究发现女贞子多糖的重均相对分子质量为10 721，数均相对分子质量为10 673，其由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖3种单糖组成，其物质的量比 9.14∶8.10∶5.18。本研究采用经典的双侧卵巢摘除术复制骨质疏松小鼠模型，研究女贞子多糖对骨质疏松的作用。研究发现与假手术组相比，模型组小鼠子宫明显萎缩，血浆中Ca、P水平显著升高，股骨干骺端BMD、Tb.N及BV/TV显著降低，Tb.Sp显著升高，呈现骨质疏松症中典型的骨丢失的特点。而给予女贞子多糖8周后能明显改善去卵巢所致的骨密度降低和骨微结构，提示女贞子多糖具有潜在的抗骨质疏松作用。

破骨细胞是体内唯一行使骨吸收功能的细胞，抑制破骨细胞分化是目前临床抗骨质疏松治疗的主要手段之一。本研究使用MCSF和RANKL诱导骨髓来源单个核细胞向破骨细胞分化，同时给予女贞子多糖，观察女贞子多糖对破骨细胞分化的影响。目前研究中药多糖对破骨细胞分化的影响给药剂量从 1×10-4mg/mL 到 1×10-1mg/mL 不等[23-24]。本研究女贞子多糖相关细胞实验给药浓度是综合参考已发表多糖相关细胞实验的基础上，进行CCK-8细胞活力检测以及破骨细胞分化相关预实验后最终确定的女贞子多糖给药剂量。首先，CCK-8实验结果显示 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL 女贞子多糖对破骨前体细胞活性无显著影响的（P>0.05），然后在MCSF和RANKL诱导破骨前体细胞向破骨细胞分化的同时给予上述剂量的女贞子多糖，5 d后检测培养上清中TRAP活性，发现给予女贞子多糖处理后TRAP活性明显降低，说明 1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/mL 女贞子多糖具有抑制骨髓来源的单个核细胞向破骨细胞分化的能力，而非抑制破骨前体细胞活力。

骨代谢平衡与体内钙磷代谢关系密切[2，25-26]，因此调节钙磷代谢对维持骨代谢平衡具有重要意义。体内实验发现女贞子多糖可以降低血浆Ca和P水平，体外实验发现女贞子多糖能抑制MCSF和RANKL诱导的骨髓来源单个核细胞向破骨细胞分化，降低TRAP酶活性，说明女贞子多糖可能通过调节钙磷代谢和抑制破骨细胞分化发挥抗骨质疏松作用。但女贞子多糖是如何影响钙磷代谢尚不明确，是否影响肠钙磷吸收、促进骨组织中钙沉积或降低尿钙排泄，需要进一步实验研究。综上所述，研究证实女贞子多糖能有效抑制去卵巢所致的骨密度降低，其可能与调节骨代谢平衡和钙磷代谢有关。本研究为女贞子多糖应用于绝经后骨质疏松症治疗提供理论依据。