维药土提汤水提物和醇提物抗炎镇痛作用及其对急性咽炎的治疗作用比较*

崔柏宁，阿布都卡地尔·阿布力米提，热汗古丽·买买提江，阿迪力·艾斯托拉，胡鹏，王艳，何新，3

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.和田地区维吾尔医医院，和田 848000；3.广东药科大学，广州 510006）

“体液质学说”是维吾尔医学的基本学说之一。“体液质学说”认为人体含有胆液质、血液质、黑胆质和黏液质4种体液，只有这4种体液保持动态平衡状态才能维持机体健康。土提汤是由锦灯笼、地锦草、龙葵果等14味药组成，有降低血液质和胆液质的热性、清血、清热解毒、润喉消肿、止咳化痰、顺通呼吸的功效，常用于治疗急慢性咽炎、扁桃体炎和食管炎等。土提汤是和田地区维吾尔医医院的协定处方制剂，因其配伍合理，疗效突出，已为千百万名患者解除了病痛。

急性咽炎是发生在咽部黏膜和黏膜下组织的急性炎症，临床表现为红肿热痛和咽部干涩等，常波及到咽部的淋巴组织，炎症甚至可以波及整个咽部。后期可发展为慢性咽炎，甚至可能引发中耳炎、喉炎、鼻窦炎等严重的并发症[1]。现代医学对急性咽炎的治疗，主要采用抗生素类药物以及抗病毒药物[2-4]，但具有较大的毒副作用，且易产生耐受性。

本研究以不同提取溶剂提取的土提汤提取物为研究对象，通过二甲苯致小鼠耳肿胀模型、完全弗氏佐剂致大鼠足肿胀模型以及腹腔血管通透性实验研究土提汤水提物和醇提物对急性炎症的治疗作用，并通过热板法和甩尾法考察土提汤水提物和醇提物的镇痛作用[5-7]，通过氨水致大鼠急性咽炎模型[8]，考察土提汤水提物和醇提物对急性咽炎的改善作用，为维吾尔族方土提汤的药理学研究提供实验依据。并通过水提物与醇提物作用对比，为后续剂型改进提供实验依据，为土提汤的进一步开发与应用提供基础依据。

1 材料

1.1 实验动物 KM小鼠，体质量19～21 g；Wistar大鼠，体质量180～220 g；购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2016－0006。

1.2 实验试剂 二甲苯（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号：20180315），完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，批号：22049），15%氨水（天津市佳兴玻璃仪器工贸有限公司，批号：20130112），醋酸（天津渤化化学试剂有限公司，批号：181121），大鼠肿瘤坏死因子－α（TNF－α）酶联免疫试剂盒（艾美捷科技有限公司，批号：201904）。

1.3 实验仪器 MULTISKANMK3多功能酶标仪（美国Thermo公司），电子分析天平（M0ETTERTOLEDO公司），高速离心机（美国EECKMAN公司，ALLEGRA-64R），YLS－7B 足跖容积测量仪[安合盟（天津）科技发展有限公司]，RB-200智能热板仪（成都泰盟有限公司），SW200-尾痛仪（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 土提汤提取物的制备

2.1.1 土提汤处方 药桑葚干30 g，小红枣30 g，黑桑葚干30 g，铁线蕨15 g，神香草15 g，破布木果15 g，锦灯笼 15 g，天山堇菜 10 g，地锦草 10 g，睡莲花 10 g，小茴香 10 g，龙葵果 10 g，藿香 10 g，小豆蔻6 g。

2.1.2 土提汤水提物的制备 取“2.1.1”项下药材，用10倍量蒸馏水浸泡24 h后，文火煎煮2次，每次1.5 h，合并2次煎出液，静置去除沉淀，浓缩成浸膏，4℃贮存。

2.1.3 土提汤醇提物的制备 取“2.1.1”项下药材，用10倍量50%乙醇浸泡24h后，水浴回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，静置去除沉淀，浓缩成浸膏，4℃贮存。

2.2 土提汤提取物镇痛作用研究

2.2.1 热板法 取预筛选合格的32只KM雌性小鼠[（55.0±0.5）℃，5～30 s内舔后足]，按体质量随机分为4组：空白组（等体积生理盐水）、阳性组（阿司匹林片0.25 g/kg）、土提汤水提物组（生药20.63 g/kg）、土提汤醇提物组（生药20.63 g/kg），每组8只。各组小鼠均给药3 d，并于第3 d用热板法分别测定给药后0.5、1、2、4 h各小鼠的痛阈2次，痛阈值超过60 s以60 s计算，取平均值作为基础痛阈。比较不同时间的各组间基础痛阈值差异，判断是否有镇痛作用[9]。

2.2.2 甩尾法 取预筛选合格的32只KM雌性小鼠（甩尾时间在5～30 s），分组方法及给药剂量同“2.2.1”。各组小鼠均给药3 d，并于第3 d用甩尾法分别测定给药后0.5、1、2、4 h各组小鼠的甩尾时间1次，甩尾时间超过60 s以60 s计算，比较不同时间的各组间甩尾时间差异，判断是否有镇痛作用[9]。

2.3 土提汤提取物抗炎作用研究

2.3.1 小鼠耳肿胀法 取正常小鼠40只（雌雄各半），按体质量随机分为5组：空白组（等体积生理盐水）、模型组（等体积生理盐水）、阳性组（醋酸地塞米松片0.63 mg/kg）、土提汤水提物组（生药20.63 g/kg）、土提汤醇提物组（生药 20.63 g/kg），每组各8只。按组分别灌胃给药3 d，末次给药前一晚给动物禁食。第3 d给药60 min后，小鼠右耳均匀涂抹50 μL二甲苯致炎，致炎30 min后断颈处死小鼠，沿小鼠耳廓基线剪下双侧耳廓，用打孔器在两侧耳廓对称处各打下耳片。电子分析天平称耳片质量，以左右耳片质量之差作为肿胀程度，计算肿胀抑制率，记录实验数据和结果[9]。

2.3.2 醋酸致炎小鼠腹腔血管通透性 取正常小鼠32只，按体质量随机分为4组：模型组（等体积生理盐水）、阳性组（醋酸地塞米松片0.63 mg/kg）、土提汤水提物组（生药20.63 g/kg），土提汤醇提物组（生药20.63 g/kg），每组各8只。按组分别灌胃给药3 d，末次给药90 min后尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液按小鼠体质量每10 g给予0.1 mL计算，过10 min后腹腔注射0.7%冰醋酸，再过20 min后处死小鼠，于腹腔中注射5 mL生理盐水进行冲洗。取洗出液3 mL，1 000 r/min离心5 min，离心半径5.96 cm，用紫外-可见分光光度计于λ=590 nm处，测定上清液的吸光度。

2.3.3 大鼠足肿胀法 取Wistar雄鼠24只，按体质量随机分为4组：空白组（等体积生理盐水），模型组（等体积生理盐水），土提汤水提物组（生药20.63 g/kg），土提汤醇提物组（生药 20.63 g/kg），每组各6只。模型组与给药组的大鼠右后足跖皮内注射完全弗氏佐剂0.1 mL致炎，7 d后进行二次免疫，周期19 d。按组分别灌胃给药7 d，给药1、3、7 d分别以容积法测量大鼠右后足跖的体积。末次给药前一晚给动物禁食。末次给药2 h后处死大鼠。

2.4 土提汤提取物对急性咽炎大鼠治疗效果研究取Wistar雄鼠42只，按体质量随机分为7组：空白组（等体积生理盐水），模型组（等体积生理盐水），阳性组（阿司匹林片2.46 mg/kg），土提汤水提物低剂量组（生药6.87 g/kg），土提汤水提物高剂量组（生药20.63 g/kg），土提汤醇提物低剂量组（生药6.87g/kg），土提汤醇提物高剂量组（生药20.63 g/kg），每组各6只。使用喉头喷雾器将15%的氨水向大鼠咽部喷雾，每天2次，每次喷3下，连续喷3 d，咽部黏膜在15%氨水的刺激下充血肿胀，形成急性咽炎模型。空白组以相同的方法喷雾蒸馏水。造模3 d后，给予相应药物，持续3 d，每日观察并记录造模后各组大鼠状况，观察咽部黏膜变化。末次给药2 h后，乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2 h，5 000 r/min离心 15 min（4℃），取上清，ELISA 检测大鼠血清中TNF-α的水平，操作步骤按试剂盒说明书进行；取咽部组织与肺部组织，用生理盐水冲洗后保存于福尔马林中[9]。

大鼠解剖取材组织（咽部和肺脏）于10%福尔马林溶液固定，咽部组织脱钙，经ASP200S全自动组织脱水机脱水浸蜡，Leica EG1150H组织包埋机包埋，Leica RM2255全自动切片机制片，HE染色。观察方法：Nikon Ci-L显微镜观察，HMIAS-2000高清晰度数码显微图像分析系统采图。

2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 土提汤提取物对小鼠热板法痛阈值的影响 土提汤水提物，土提汤醇提物和阿司匹林片给药后，小鼠疼痛反应时间逐渐增加，于2 h处达到最大。与空白组相比，阳性组（阿司匹林片）和土提汤醇提物组能明显增加小鼠疼痛反应时间（P＜0.05），说明土提汤提取物具有良好镇痛效果，且醇提物的镇痛效果比水提物更明显（P＜0.05）。见表1。

表1 土提汤提取物对小鼠热板法疼痛反应时间的影响（±s）Tab.1 Effect of Tuti Decoction extract on the pain response time of hot-plate procedure in mice（±s）

表1 土提汤提取物对小鼠热板法疼痛反应时间的影响（±s）Tab.1 Effect of Tuti Decoction extract on the pain response time of hot-plate procedure in mice（±s）

注：每组同一时间点跟空白对照的同一时间点比较，*P<0.05，**P<0.01。

痛阈值（s）基础阈值 0.5 h 1 h 2 h 4 h空白组 8 16.01±3.76 18.13±2.25 18.05± 3.35 17.24± 3.11 16.51± 3.50阳性组 8 18.70±6.29 21.80±8.76* 22.18± 7.20* 25.02± 7.04* 24.36± 7.45*水提取物组 8 18.50±4.53 17.90±4.03 17.92± 3.86 20.58± 4.07 18.14± 5.38醇提取物组 8 18.97±4.44 16.72±4.48 25.31±17.28* 29.34±16.70** 27.27±16.70*组别 动物数

3.2 土提汤提取物对小鼠光热刺激法甩尾痛阈值的影响 土提汤水提物、土提汤醇提物和阿司匹林片给药后，小鼠疼痛反应时间逐渐增加，于1 h处达到最大，且醇提物的镇痛效果较水提物更好，但差异无显著性。与空白组相比，阳性组（阿司匹林片）、土提汤水提物组和土提汤醇提物组均能明显增加小鼠疼痛反应时间（P＜0.05），说明土提汤提取物具有良好镇痛效果。见表2。

表2 土提汤提取物对小鼠光热刺激法疼痛反应时间的影响（±s）Tab.2 Effect of Tuti Decoction extract on the pain response time of photothermal stimulation in mice（±s）

表2 土提汤提取物对小鼠光热刺激法疼痛反应时间的影响（±s）Tab.2 Effect of Tuti Decoction extract on the pain response time of photothermal stimulation in mice（±s）

注：每组同一时间点跟空白对照的同一时间点比较，*P<0.05，**P<0.01。

痛阈值（s）基础阈值 0.5 h 1 h 2 h 4 h空白组 8 7.51±1.87 7.10±1.72 7.12±1.06 7.21±0.51 6.59±1.94阳性组 8 8.26±1.64 8.12±1.97* 10.08±2.93** 9.88±2.23* 9.88±2.23水提取物组 8 7.62±1.69 9.04±2.93 11.33±2.96** 7.80±1.39 7.14±1.62醇提取物组 8 8.08±1.71 9.98±5.69 12.46±6.54* 9.50±2.48* 7.92±2.14组别 动物数

3.3 土提汤提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 与模型组比较，土提汤水提物组、土提汤醇提物组和阳性组（醋酸地塞米松片）可显著降低二甲苯所致小鼠耳肿胀，其中，土提汤水提物组抑制率为（44.89±14.89）%，土提汤醇提物组抑制率为（40.16±15.41）%，醋酸地塞米松片抑制率为（42.28±14.15)%。见表3。

表3 土提汤提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（±s）Tab.3 Effect of Tuti Decoction extract on ear swelling induced by xylene in mice（±s）

表3 土提汤提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（±s）Tab.3 Effect of Tuti Decoction extract on ear swelling induced by xylene in mice（±s）

注：与空白组相比，**P＜0.01；与模型组相比，##P＜0.01。

组别 动物数 剂量 肿胀度（g） 抑制率（%）空白组 8 - 1.37±0.89 -模型组 8 - 13.32±1.85** -阳性组 8 0.63 mg/kg 7.69±1.88## 42.28±14.15水提取物组 8 20.63 g/kg 7.34±1.98## 44.89±14.89醇提取物组 8 20.63 g/kg 7.97±2.05## 40.16±15.41

3.4 土提汤提取物对小鼠腹腔血管通透性的影响 与模型组相比，阳性组、土提汤水提物组和土提汤醇提物组小鼠腹腔洗出液的吸光度都明显下降（P＜0.05），说明土提汤提取物能降低腹腔血管通透性，具有抗炎作用。见图1。

图1 小鼠腹腔洗出液吸光度（±s，n=8）Fig.1 Absorbance of the washing liquid from the abdominal cavity of mice（±s，n=8）

3.5 土提汤提取物对大鼠足肿胀的影响 造模后，与空白组相比，模型组、土提汤水提物组和土提汤醇提物组大鼠足趾容积明显增大（P<0.01）。给药后，土提汤水提物组和土提汤醇提物组的足趾容积均明显减小（P＜0.05），且土提汤醇提物组的足趾容积比水提物组更小，但无统计学差异，说明土提汤提取物能够改善大鼠足趾肿胀度，具有抗炎作用。见表4。

表4 土提汤提取物对大鼠足趾容积的影响（±s）Tab.4 Effect of Tuti Decoction extract on the paw volume change in rats（±s）

表4 土提汤提取物对大鼠足趾容积的影响（±s）Tab.4 Effect of Tuti Decoction extract on the paw volume change in rats（±s）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 动物数 足趾容积（mL）1 d 3 d 7 d空白组 6 2.54±0.20 2.59±0.16 2.50±0.45模型组 6 3.60±0.39** 4.56±1.02** 4.92±0.88**水提取物组 6 4.09±0.70** 4.62±0.31** 3.63±0.41**#醇提取物组 6 4.02±0.63** 4.44±0.91** 3.42±0.51**##

3.6 土提汤提取物对氨水致急性咽炎大鼠的影响

3.6.1 土提汤提取物对急性咽炎大鼠一般状态的影响 造模后，与空白组大鼠相比，模型组大鼠表现为搔抓口鼻部，呼吸急促，嘶哑，进食减少，饮水增多，咽部红肿，毛色失去光泽光泽。给药后，与模型组大鼠相比，给药组大鼠症状均有不同程度好转，呼吸平稳，咽部红肿改善，饮食增多。

3.6.2 土提汤提取物对急性咽炎大鼠组织病理学的影响

3.6.2.1 土提汤提取物对急性咽炎大鼠咽部组织病理学的影响 空白组大鼠咽部组织结构完整，各层分界较清晰，黏膜上皮未见明显过度角化和钉突状改变，固有层未见明显炎细胞浸润、血管扩张、纤维组织增生及腺体肥大。与空白组相比，模型组大鼠咽部黏膜上皮可见过度角化和钉突状改变，固有层可见血管扩张及炎性物质浸润和纤维组织增生，腺体肥大。与模型组相比，阳性组、土提汤水提物低剂量组、土提汤水提物高剂量组、土提汤醇提物低剂量组和土提汤醇提物高剂量组大鼠咽部黏膜上皮层水肿和增生状况均减轻，炎性渗出物均减少。见图2。

图2 土提汤提取物对急性咽炎大鼠咽部组织的病理学影响（HE，×100）Fig.2 The pathological effects of Tuti Decoction extract on the pharyngeal tissue of rats with acute pharyngitis(HE，×100)

3.6.2.2 土提汤提取物对急性咽炎大鼠肺部组织病理学的影响 空白组大鼠肺泡壁内毛细血管未充血，肺泡腔内无炎性渗出物，肺泡腔大小正常，肺泡数量正常。与空白组相比，模型组大鼠肺间质充血，炎细胞浸润明显，血管周围组织水肿。与模型组比较，阳性组大鼠肺泡腔内炎性渗出物减少；土提汤水提物低剂量组、土提汤水提物高剂量组、土提汤醇提物低剂量组和土提汤醇提物高剂量组大鼠血管周围组织水肿的情况均有所缓解，炎性渗出物均明显减少，肺间质充血情况均缓解，其中以土提汤醇提物高剂量组改善状况最为明显。见图3。

图3 土提汤提取物对急性咽炎大鼠肺部组织的病理学影响（HE，×100）Fig.3 The pathological effects of Tuti Decoction extract on the lung tissue of rats with acute pharyngitis(HE，×100)

3.6.3 土提汤提取物对急性咽炎大鼠血清中TNF-α的影响 与空白组相比，模型组大鼠血清中TNF-α含量明显的升高（P＜0.01）。与模型组相比，阳性组，土提汤水提取物高剂量组及醇提物高低剂量组TNF-α含量显著降低（P＜0.01），且醇提取物对TNF-α含量的降低作用随给药剂量的增加而增强。见表5。

表5 土提汤提取物对急性咽炎大鼠血清TNF-α的影响（±s）Tab.5 Effects of Tuti Decoction extract on serum TNF-α in rats with acute pharyngitis（±s）

表5 土提汤提取物对急性咽炎大鼠血清TNF-α的影响（±s）Tab.5 Effects of Tuti Decoction extract on serum TNF-α in rats with acute pharyngitis（±s）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 动物数 剂量 TNF-α（ng/mL）空白组 6 - 141.18±4.17**模型组 6 - 298.57±28.42阳性组 6 2.46 mg/kg 196.39±22.82**水提取物低剂量组 6 6.87 g/kg 250.62±36.23水提取物高剂量组 6 20.63 g/kg 216.41±19.44**醇提取物低剂量组 6 6.87 g/kg 233.57±14.18*醇提取物高剂量组 6 20.63 g/kg 203.59±17.41**

4 讨论

土提汤是由小红枣、黑桑葚干、锦灯笼、天山堇菜、地锦草、龙葵果为主药，药桑葚干、铁线蕨、神香草、破布木果、睡莲花、小茴香、藿香、小豆蔻为辅药的 14 味药组成，具有抗炎[10-16]、抗菌[17-18]、止咳、祛痰、平喘[19-23]等药理作用，常用于治疗急性咽炎。

急性咽炎，属中医风热喉痹范畴是一种以咽部疼痛为主要症状的常见喉部疾病。炎症可扩散至整个咽部，或扩散至邻近器官，可引起中耳炎、喉炎、鼻窦炎等严重并发症，给人们的正常工作和生活带来极大的困扰。维吾尔族处方土提汤用于治疗急性咽炎，本研究开展了土提汤提取物抗炎镇痛作用研究和土提汤提取物治疗咽炎的实验研究。

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，早期炎症表现为毛细血管扩张、通透性增加；中期炎症表现为白细胞趋化游走；晚期炎症表现为结缔组织增生、肉芽肿形成[24]，其局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍，全身反应为发热、白细胞增多、实质器官病变等。

急性咽炎属于早期炎症。因此本实验通过高位中枢参与的热板反应实验和脊髓反射参与的甩尾反应实验进行镇痛实验，实验结果显示土提汤水提物和醇提物灌胃给药能明显延长热板法和甩尾法所致小鼠的痛阈值，这说明土提汤提取物具有中枢镇痛作用，且对高位中枢和脊髓反射参与的疼痛均有镇痛作用。二甲苯致小鼠耳廓肿胀及完全弗氏佐剂致大鼠足跖肿胀是以水肿和渗出为主的急性炎症反应[25]，实验结果显示土提汤水提物和醇提物灌胃给药明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓的肿胀，明显减轻完全弗氏佐剂所致大鼠足跖肿胀，表明土提汤提取物对急性炎症具有良好抑制作用。小鼠毛细血管通透性实验证明土提汤提取物能够抑制毛细血管扩张，降低毛细血管通透性，从而抑制炎症反应。急性咽炎实验结果显示，土提汤提取物能够明显改善急性咽炎大鼠的咽组织及肺组织病变，同时显著降低大鼠血清中炎症因子的含量，表明土提汤提取物对急性咽炎具有良好疗效。

综上所述，土提汤水提物和醇提物均能有效改善炎症模型中耳肿胀和足肿胀程度，并可降低腹腔血管通透性，增长小鼠疼痛反应时间，表明土提汤提取物具有良好镇痛抗炎作用；土提汤提取物能够明显改善急性咽炎大鼠的咽组织及肺组织病变，降低血清中炎症因子的含量，对急性咽炎具有良好疗效，且土提汤提取物对急性咽炎的治疗作用是通过减少肿胀、渗出、镇痛来实现的。与水提物相比，醇提物的镇痛抗炎作用更好，但无显著性差异，为后续剂型改进，研发防治或改善急性咽炎新型药物制剂提供实验依据。