微小RNA-10a联合甲胎蛋白、糖类抗原50、糖类抗原19-9检测在结直肠腺癌早期诊断中的价值

赵 旭，仝 聪，李 毅，阎立昆

(陕西省人民医院普外一科，陕西 西安 710068)

结直肠癌为消化系统常见恶性肿瘤，以腺癌居多。近年研究[1]发现，随着我国人民生活方式及饮食习惯的改变，结直肠腺癌患病率呈逐年升高趋势。结直肠腺癌预后与病理分期密切相关，流行病学调查[2]显示，早期结直肠腺癌可治愈，5年生存率高达90%，晚期结直肠腺癌5年生存率不足10%，故及时诊断早期结直肠腺癌有其必要性。目前，诊断结直肠腺癌的金标准仍为病理学检查，但该方法为有创性操作，不能作为筛查项目在临床普及[3]。血清肿瘤标志物在近年恶性肿瘤筛查中发挥了重要作用，其中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)、糖类抗原50(Carbohydrate antigen 50，CA50)、糖类抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA199)等均与消化道恶性肿瘤发生和发展相关，但也缺乏足够的灵敏度及特异度[4]。微小RNA(microRNA)是一种非编码RNA，可调控细胞生长、增殖、分化及凋亡。microRNA-10a为microRNA家族中的一种，有研究[5]指出其在消化系统恶性肿瘤中高表达，且参与肿瘤的发生及发展。但目前microRNA-10a与消化系统恶性肿瘤的关系多集中于体外实验，是否能作为早期结直肠腺癌的筛查指标则较少报道。基于此，本研究对早期结直肠腺癌患者和结直肠良性病变者的临床资料进行比较，评估上述指标及其联合检测对早期结直肠腺癌的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2017年1月至2020年1月我院收治的108例早期结直肠腺癌患者临床资料(结直肠腺癌组)。病例纳入标准：经病理学确诊，且分期符合《中国早期结直肠癌及癌前病变筛查与诊治共识意见》[6]制定的早期标准。排除标准：合并其他恶性肿瘤；既往有放化疗等抗肿瘤治疗史；伴免疫系统疾病、血液系统疾病或急慢性感染。经倾向性得分匹配法收集与结直肠腺癌组性别、年龄、病变部位1∶1匹配的108例结直肠良性病变者临床资料(良性组)。良性组与结直肠腺癌组排除标准一致。

1.2 检测方法 收集两组患者入院次日清晨空腹静脉血5 ml，经3000 r/min离心10 min，获得血清样本。向500 μl血清标本中加入等体积裂解液MZ(批号：161119、190128，德国QIAGEN公司)，经涡旋震荡、静置、离心、水相转移等操作后，提取血清RNA，采用Nanodrop超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司)检测230、260、280 nm处吸光度，在OD260/OD280为1.8～2.0且OD260/OD230>2.0时视为提取RNA成功，不符合要求者重新取样检测。采用基于茎-环引物的实时定量PCR(Stem-Loop RT-qPCR)法引入靶向特异性反转录物，引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACCAC-

AAATT-3’，该反转录引物与成熟microRNA结合形成复合体，并向microRNA 5’末端延伸，获得较长的反转录扩增子，接着行RT-PCR，正向引物序列为5’-TGCGGTACCCTGTAGATCCG-3’，反向引物序列为5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，65 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min，溶解曲线分析温度为60～95 ℃。采用相对法定量分析microRNA-10a表达水平，试剂由日本TAKARA BIO公司生产，仪器购自美国Bio- Rad公司。采用电化学发光法检测血清AFP、CA50、CA199水平，试剂盒仪器均购自德国罗氏公司。

2 结 果

2.1 两组患者一般资料比较 见表1。两组患者性别、年龄、病变部位比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比较 见表2。结直肠腺癌组血清microRNA-10a、 AFP、CA50、CA199水平显著高于良性组(均P<0.05)。

表2 两组患者血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199水平比较

2.3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其联合检测对早期结直肠腺癌诊断价值分析 见表3(图1)。经ROC曲线分析，血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199对早期结直肠腺癌均有较高诊断价值，且四项联合检测诊断价值更高。

表3 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其联合检测对早期结直肠腺癌诊断价值

图1 血清microRNA-10a、AFP、CA50、CA199及其联合检测诊断早期结直肠腺癌ROC曲线

3 讨 论

恶性肿瘤的早期发现对提升治愈率及生存率至关重要，肿瘤早期筛查工作也在临床逐渐开展[7]。血清肿瘤标志物具有检测简便、普及度较高等优点，成为肿瘤早期筛查的主要检测项目[8]。其中，AFP为肝脏合成分泌的糖蛋白，是原发性肝癌的公认标志物[9]。近年研究[10]也发现，AFP在头颈部、消化道恶性肿瘤中高表达，对辅助诊断其他恶性肿瘤也有利。CA50也是一种广谱肿瘤标志物，在糖基化酶被激活、细胞表面糖基结构改变时生成，可高表达于结直肠癌等消化道恶性肿瘤[11]。CA199为黏蛋白型糖类蛋白肿瘤标志物，对腺癌敏感，在胰腺癌、结直肠癌中均高表达[12]。本研究也发现，结直肠腺癌组血清AFP、CA50、CA199水平均显著高于良性组，提示血清AFP、CA50、CA199对辅助诊断早期结直肠腺癌有利。不仅如此，血清AFP、CA50、CA199对早期结直肠腺癌均有较高诊断价值，其截断值分别为6.74 ng/ml、23.80 U/ml、27.80 U/ml，也表明3项肿瘤标志物可用于早期结直肠腺癌的临床筛查。需要注意的是，AFP、CA50、CA199检测值还受检测方法及试剂厂家等因素的影响，上述截断值仅供临床参考。此外，上述广谱肿瘤标志物在筛查结直肠腺癌的灵敏度及特异度仍不高，还需与其他标志物联合检测，以提高诊断价值[13]。

microRNA为非编码RNA，在RNA诱导沉默复合体的引导下可对靶mRNA进行降解或翻译抑制，发挥对靶基因表达的调控作用，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等一系列生理病理过程，故microRNA表达水平的失常可诱发肿瘤等疾病[14]。Chen等[15]指出，异常表达的microRNA可经细胞周期、程序性细胞死亡、侵袭及血管生成等反应，调控肿瘤的发生、发展、转移。因此，microRNA的表达水平在恶性肿瘤诊断、治疗及预后判断中的应用效果成为国内外学者研究的热点[16-17]。microRNA-10a为近年发现的在原发性肝癌、膀胱癌等恶性肿瘤中表达异常的一种microRNA，可参与造血细胞分化及肿瘤细胞发生发展、免疫调节等生理病理过程[18]。Luo等[19]也指出，可能受作用基因位点或信号传导途径不同等因素影响，microRNA-10a在不同恶性肿瘤中表达水平不一，可作为多种恶性肿瘤筛查的敏感指标。研究[20]发现，microRNA-10a在急性髓样白血病中高表达，但在慢性髓样白血病中低表达，并通过调控粒细胞巨噬细胞集落刺激因子2的分泌加速细胞增殖。Yan等[21]研究发现，microRNA-10a在膀胱癌、胰腺癌中高表达，在食管癌、乳腺癌中低表达，因此microRNA-10a在各恶性肿瘤中发挥的效应不同。然而，低于microRNA-10a在结直肠癌中的表达水平，相关报道较少。对此，本研究发现，结直肠腺癌组血清microRNA-10a表达水平显著高于良性组，且血清microRNA-10a对早期结直肠腺癌有较高诊断价值。这也说明，通过Stem-Loop RT-qPCR技术检测血清microRNA-10a相对表达量能辅助筛查早期结直肠腺癌。然而，Stem-Loop RT-qPCR技术要求较高，且对提取的RNA质量有要求，基层医疗机构尚无此检测项目，在临床推广及普及度方面不及上述广谱肿瘤标志物，也是microRNA-10a作为筛查指标的缺陷[22-23]。本研究还发现，血清microRNA-10a与AFP、CA50、CA199联合检测对早期结直肠腺癌诊断价值更高，提示结直肠腺癌的发生、发展与多条信号通路相关，单一血清学检测在判断早期结直肠腺癌时仍然存在不足，应结合多项指标共同评估，以避免漏诊，提高诊断准确率，尽可能地筛查出早期结直肠腺癌患者。Liu等[24]还发现，microRNA-10a表达量与恶性肿瘤恶性程度关系密切，其表达量与食管鳞状细胞癌分化程度具有显著相关性，对预测患者预后有利，故推测microRNA-10a表达量可能还与结直肠腺癌临床特征有关。

综上所述，血清microRNA-10a及肿瘤标志物AFP、CA50、CA199均能辅助临床诊断早期结直肠腺癌，但四项联合检测诊断价值更高，有望纳入直肠腺癌的常规筛查项目。但由于本研究为回顾性分析，收集资料有限，仅纳入了早期结直肠腺癌患者，为评估microRNA-10a表达水平与结直肠腺癌分期、分化程度等临床特征的关系，还需后续采用大样本量进一步分析。