微波辐射对雌性小鼠卵巢功能的近期影响

王晶晶，陈书强，董 杰，雷 晖，王晓红

空军军医大学第二附属医院 妇产科生殖医学中心，陕西西安 710038

微波通常指频率为300 MHz～ 300 GHz 的电磁波，是一种非电离性电磁辐射。既往研究表明，微波辐射所属的电磁波区域是辐射产生生物学效应的关键区域[1]。微波技术在国防、通讯、医疗和日常生活等领域的广泛应用(雷达L 波段1～2 GHz、S 波段2～ 4 GHz，手机1.8～ 2 GHz，微波炉915～ 2 450 MHz)，在给人们工作生活带来便利的同时，也对人们的健康造成了潜在危害。卵巢是女性的重要生殖腺，也是微波辐射作用敏感的靶器官之一[2]。有研究报道，不同频率的微波辐射可以影响生殖细胞的形态、功能以及细胞的凋亡，高频微波辐射可以明显增加不孕不育风险，甚至导致死胎、畸胎、流产和发育畸形[3-5]。目前微波辐射及其生殖损伤的研究主要集中在男性，对女性的研究相对较少，微波辐射对女性生殖系统的损伤是亟须解决的一个重要问题。本研究主要探讨2 GHz(属于S 波段雷达和手机的工作频率)微波辐射暴露对雌性小鼠卵巢及功能的近期影响。

材料与方法

1 实验动物 ICR 小鼠64 只购自西安交通大学动物实验中心，饲养环境温度保持在23℃左右，湿度保持在50%左右，饲料为Co60照射的全价营养饲料。室内照明采用12 h/12 h 明暗交替。

2 实验分组 将64 只性成熟雌性ICR 小鼠按照辐射强度随机分为4 组，每组16 只，对照组不进行辐射(0 w/m2)。辐射组采用高功率连续波微波辐射装置(由西北核技术研究所提供。信号源：美国安捷伦Agilent 公司；功率放大器：德国波恩BONN 公司)，频率设置为2 GHz(属于雷达S 波段和手机的工作频率)，设置3个辐射梯度：0.5 w/m2(低剂量组)，1.5 w/m2(中剂量组)，2.5 w/m2(高剂量组)。每天固定在8：00 -9：00 进行1 h 辐射，连续辐射14 d。

3 血清激素水平检测 连续微波辐射14 d 后，每组随机选择6 只雌鼠称重，之后取雌鼠眼球血置于1.5 mL 的EP 管中，室温静置6 h，3 000 r/min离心10 min，取上清移至新的洁净EP 管中，于-80℃保存。按照试剂盒说明书(武汉赛培生物)，采用酶联免疫吸附法(ELISA) 检测雌鼠血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黄体激素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)水平。

4 卵巢指数分析及卵巢HE 染色 脱颈法处死雌鼠，分离卵巢组织，用滤纸吸干表面水分后称重。卵巢指数=卵巢重量(mg)/体质量(g)×100%。一侧卵巢置于3%多聚甲醛中固定24 h，之后包埋切片并进行苏木精-伊红染色(HE 染色)，分析卵巢的组织形态结构变化。

5 卵巢氧化应激水平检测 另一侧卵巢进行匀浆，按照试剂盒步骤(南京建成生物)，通过化学比色法，检测卵巢组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)的活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)浓度。

6 子宫指数分析及相关因子检测 分离子宫，用滤纸吸干表面水分后称重。子宫指数=子宫重量(mg)/体 质 量(g)×100%。采 用qRT-PCR 检 测 小鼠子宫中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 及血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的表达水平，严格按照试剂盒说明书提取子宫组织总RNA，反转录成cDNA，以β-actin 作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因在mRNA 相对表达水平，引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

7 定点交配 辐射14 d 后，将各组剩余的10 只雌性小鼠，与既往曾交配过的正常雄性小鼠(9 周龄) 合笼(雌雄比例=2∶1)。次日上午8：00 左右观察雌鼠阴道口是否出现阴栓，如观察到阴栓则视为交配成功，记作妊娠0.5 d。若未见阴栓，可于下午5：00 左右继续合笼交配，持续1 周。

8 雌鼠生育力评估 妊娠18.5 d 后将孕鼠脱颈法处死，解剖后记录每只孕鼠窝仔数，并统计受孕率(受孕数/雌鼠总数)。根据胎鼠肛门与生殖器的距离以及形态鉴别子代性别(雌鼠肛门距生殖器较近，肛门和生殖器之间形态为缝状；雄鼠肛门距生殖器较远，肛门和生殖器之间形态为柱状)。

9 统计学方法 所有数据通过SPSS 20.0 统计学软件进行分析，计量资料以表示，多组间行单因素方差分析，两两比较采用HSD-q检验；计数资料用率(%) 表示，进行χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 微波辐射暴露对雌鼠激素水平的影响 比较四组雌鼠的性激素水平，LH 和FSH 水平均无统计学差异(P＞0.05)。E2及卵巢指数均有统计学差异(P＜0.05)。与对照组相比，3个暴露组的血清LH、FSH 水平略有升高，但差异无统计意义(P＞0.05)，高剂量组血清E2及卵巢指数明显降低，和其他各组的差异多有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 微波辐射暴露对雌鼠激素水平的影响(n=6)Tab.2 Effect of microwave radiation exposure on the hormone level of estrogen in mice (n=6)

2 微波辐射暴露对雌鼠卵巢的影响 比较雌鼠的卵巢组织结构，对照组小鼠卵巢结构清晰完整，各级卵泡丰富且发育良好，颗粒细胞层次多且排列整齐，闭锁卵泡很少(图1A)；暴露组卵巢结构出现不同程度的损伤，HE 染色表现黄体数目减少，颗粒细胞层变薄且层次紊乱，颗粒细胞数目减少，成熟卵泡个数明显减少，闭锁卵泡个数明显增多(图1B～ 图1D)。

图1 微波辐射暴露对雌鼠卵巢结构的影响(200×。黑色箭头示正常卵泡；黄色箭头示闭锁卵泡)A：对照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组Fig.1 Effect of microwave radiation exposure on the ovarian structure of female mice (200×.Black arrows:normal follicles;yellow arrows:atretic follicles)A:control group;B:low-dose group;C:middle-dose group;D:high-dose group

3 微波辐射暴露对雌鼠卵巢氧化应激水平的影响 比较四组雌鼠卵巢的氧化应激水平，SOD、CAT和MDA 水平均有统计学差异(P＜0.05)。与对照组相比，高剂量组暴露后，雌鼠卵巢组织中SOD和CAT 含量显著降低，MDA 水平显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 微波辐射暴露对雌鼠卵巢氧化应激的影响(n=6)Tab.3 Effect of microwave radiation exposure on the oxidative stress in the ovaries of female mice (n=6)

4 微波辐射暴露对雌鼠子宫的影响 比较四组雌鼠子宫指数和子宫组织中标志分子的表达水平，子宫指数和子宫组织中VEGF 的水平均有统计学差异(P＜0.05)，子宫组织中VEGFR2 的水平无统计学差异(P＞0.05)。与对照组相比，低剂量组和中剂量组的子宫指数、子宫组织中VEGF 和VEGFR2 的表达水平无明显变化(P＞0.05)；高剂量组辐射暴露后，雌鼠子宫指数、子宫组织中VEGF 和VEGFR2 的表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 微波辐射暴露对雌鼠子宫的影响(n=6)Tab.4 Effect of microwave radiation exposure on the uterus of female mice (n=6)

5 微波辐射暴露对子代窝仔数和性别比的影响 比较四组雌鼠的受孕率和窝仔数，受孕率无统计学差异(P＞0.05)，窝仔数有统计学差异(P＜0.05)。与对照组相比，高剂量组的受孕率和窝仔数显著降低，中剂量组和高剂量组的窝仔数显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。比较各组雌鼠和雄鼠的数量，差异均统计学意义(P＜0.05)。比较雌鼠的比例，各组之间无统计学差异(P＞0.05)。见表5。

表5 微波辐射暴露对子代窝仔数和性别比的影响(n=10)Tab.5 Influence of microwave radiation exposure on litter size and sex ratio of offspring (n=10)

讨 论

目前，电磁辐射已经成为继大气污染、水资源污染、噪声污染后的“第四大环境污染源”，其给人们生活带来便利的同时，也对人们及后代的健康构成威胁[6]。据世界卫生组织(WHO) 调查显示，世界范围内育龄夫妇不孕不育发病率高达8%～ 12%，其中女性因素约占40%，且呈逐年递增趋势[7]。研究证实，女性生殖腺卵巢是微波辐射敏感的靶器官之一，容易遭受微波辐射的损伤，但微波电磁辐射对女性生殖功能的影响及其相关机制尚未阐明。

目前国内外有关微波辐射对雌性生殖功能的影响及相关机制研究，主要基于动物模型。马惠荣等[8-9]的研究结果显示，辐射组大鼠血清E2水平较正常组显著降低，卵泡和黄体直径均小于正常组，颗粒细胞层数和数量减少。Roshangar等[10]在对暴露于低频电磁场的孕鼠子代进行研究时发现，发育期暴露于电磁场中会影响雌鼠的卵母细胞分化和卵泡生成，并可能通过减少卵巢储库而导致生育能力下降。Sagioglou 等[11]发现，手机微波辐射可以加速小鼠卵母细胞凋亡。以上研究表明微波辐射可以影响雌性生殖健康。本研究同样发现2 GHz 微波辐射暴露可以导致雌鼠血清E2水平显著降低且卵巢结构出现不同程度的损伤，同时降低受孕率和子代窝仔数，导致雌鼠生育力降低。

VEGF 是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子，通过与VEGFR 结合引起一系列的信号反应，可释放多种细胞因子与生长因子，刺激血管内皮细胞的增殖与迁移，进而促进血管生成，在胚胎植入及妊娠维持过程中发挥重要作用[12]。本研究发现，2 GHz 微波辐射暴露可以导致雌鼠的子宫指数显著降低，且子宫组织中VEGF 和VEGFR2 的表达水平均受到抑制，说明微波辐射暴露可影响子宫组织的血管生成，进而影响胚胎植入和妊娠维持。

关于微波辐射对雌性生育力影响的机制，国内外研究主要集中在微波辐射可导致氧化应激反应和产生过量氧自由基，引起细胞毒性进而损伤生殖功能[13-14]。孙灵娇等[15]发现，妊娠期900 MHz(370 μW/cm2) 手机频率电磁辐射可引起大鼠不良妊娠结局，可能与胎盘组织SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶活力降低，胎盘组织氧化损伤存在密切关系。Shahin 等[16]研究显示，2.45 GHz 微波照射暴露小鼠卵巢组织中NO 水平和抗氧化酶活性显著降低，并影响小鼠胚胎着床。Sangun 等[17]的同样发现2.45 GHz 微波照射暴露后，雌性Wistar 大鼠大脑和卵巢组织中总氧化状态和氧化应激指数显著增加，进而影响其生殖功能。而抗氧化药物(如褪黑素、辅酶Q10、维生素C/E)的应用，可以有效缓解微波辐射所造成的女性生育力损伤[18-19]。本研究同样发现2 GHz 微波辐射暴露可以导致雌鼠卵巢组织中SOD 和CAT 含量显著降低，MDA水平显著升高。

综上可知，本研究发现2 GHz 微波辐射可对雌性ICR 小鼠生殖功能造成一定程度损伤，主要体现在血清E2水平降低、卵巢结构紊乱、子宫指数降低、子宫血管生成受到抑制、受孕率降低和子代窝仔数减少。探究其原因，可能是因为微波辐射诱导氧化应激产生过多氧自由基，引起细胞毒性进而损伤雌鼠生殖功能，但具体机制尚未阐明。同时，本研究也存在一些不足之处，如纳入样本量较少且未进行深入的机制研究，后期可以从线粒体功能层面对损伤机制进行深入探索。