基于生物信息学方法对慢性鼻窦炎伴鼻息肉差异基因表达的分析

王 平，郝 蕴，赵 妍，王向东，张 罗

1 首都医科大学附属北京同仁医院 耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730；2 北京市耳鼻咽喉科研究所，鼻病研究北京市重点实验，北京 100005

慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是复杂的鼻窦黏膜炎症性疾病，其在中国的发病率约为8%，其中慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRS with nasal polyps，CRSwNP)症状严重、复发率高、合并哮喘概率高，严重影响患者生活质量[1-2]。CRSwNP 发病机制包括鼻腔鼻窦上皮受损、黏膜屏障障碍，导致吸入病原体、抗原、微粒等增加，从而引起上皮下固有免疫和适应性免疫应答增加[3]。现有治疗药物主要有激素类药物、抗生素类药物、黏膜促排药等[4]。近10年来，基于患者个体免疫治疗方式的单克隆抗体治疗逐渐出现，以Th2 相关免疫因子为靶点的治疗逐渐应用于临床[5]。解析CRSwNP 中参与调控疾病进程的基因有助于寻找到该疾病的新精准治疗方法[6]。随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究将测序和生物信息学方法应用于科学研究中，利用生物信息学手段对疾病模型或生物学过程进行分析，筛选出与疾病发生或生物学过程相关的关键基因和信号通路，为临床对该疾病的早期诊断和治疗药物研发提供科学依据。本研究基于GEO 公共数据集，利用生物信息学方法，筛选出与CRSwNP 发生相关的关键基因和信号通路，以期为深入探索CRSwNP 的发病机制提供依据。

资料和方法

1 资料来源 本研究从基因表达数据集(Gene Expression Omnibus，GEO；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)按照关键词“Chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP)”检索，下载CRSwNP 相关转录组数据集GSE136825。该数据集中包含了来源于广东省人民医院、山东大学第二医院、南昌大学第一附属医院等中心的42例CRSwNP 患者[年龄(43.6 ± 16.8)岁，男性比例66.7%]鼻息肉组织和28例健康对照者[年龄(34.2 ± 12.1)岁，男性比例71.4%]鼻黏膜组织的高通量测序数据[7]。

2 差异表达基因筛选 运用R 语言软件R Studio(版本3.6.0)的Deseq2 包(1.24.0)对GEO 数据库下载的数据集进行背景校准、标准化处理和差异基因分析，根据校正后P＜ 0.05，差异倍数(fold change,FC) ≥ 3 或 ≤ 1/3 作为筛选参数，筛选出CRSwNP 的鼻息肉组织与正常组织的差异表达基因，并通过R 语言ggplot 包绘制差异表达基因的火山图，pheatmap 包绘制热图。

3 差异基因的基因本体论(gene ontology，GO)富集分析以及通路富集分析 利用Metacore 数据库(https://portal.genego.com)对筛选后的差异基因进行功能和通路上的富集分析。对GO 富集功能生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)进行注释，选取前10个GO 条目及通路富集内容。

4 蛋白质互作网络构建 使用Cytoscape 软件(版本3.7.2)，插件MCODE，插件Enrichmentmap(版本3.2.1)，分析蛋白质相互作用关系，对BP、MF、CC 进行网络可视化。

结 果

1 CRSwNP 中差异表达基因的筛选 对CRSwNP患者息肉组织和正常黏膜组织基因数据集进行预处理和筛选，根据校正后P＜ 0.05，差异倍数(FC) ≥ 3 或 ≤ 1/3 的标准，共筛选出777个差异表达基因(图1)。与正常组织比较，鼻息肉组织中上调基因为527个，下调基因为250个。在表达上调和下调的差异基因中，根据差异倍数最显著的前30个基因制作热图(图2)。

图1 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的差异表达基因的火山图：橙色标记点表示基于倍数变化(FC) ≥ 3 且同时满足P ＜0.05 的差异基因；蓝色标记点表示基于倍数变化(FC) ≤1/3 且同时满足P ＜ 0.05 的下调差异基因；灰色标记点表示无显著差异的基因Fig.1 Differential expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa:Orange dots indicate up-regulated genes based on fold change ≥ 3,with P ＜ 0.05;Blue dots indicate downregulated genes based on fold change ≤ 1/3,with P ＜ 0.05;Gray marked dots indicate genes without significant differences

图2 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的差异表达基因(Top 30)热图：橙色表示CRSwNP 中上调的差异基因，蓝色表示CRSwNP 中下调的差异基因Fig.2 Heatmap of the top 30 differential expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa:Orange indicates up-regulated genes and blue indicates down-regulated genes

2 差异表达基因的功能富集分析 对筛选出的差异基因根据上调组和下调组分别通过在线功能和通路分析软件 Metacore 进行分析，选取前10 以内的功能富集通路进行作图。在上调基因的生物过程(BP)中前5 位分别是炎症反应、防御反应、免疫系统反应、免疫反应、粒细胞趋化(图3A)；在下调基因的生物过程中前5 位分别是肌肉收缩、平滑肌收缩、肌肉系统过程、循环系统过程、血液循环(图3B)。在上调基因的分子功能(MF)方面前5 位内容分别是免疫受体活性、蛋白质结合、结合、C5L2 过敏毒素趋化受体结合、金属肽酶活性(图4A)；在下调基因的分子功能方面前5 位分别是血红蛋白结合、多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶活性、结合、乙酰氨基半乳糖基转移酶活性、叶酸结合(图4B)。在上调基因的细胞组分(CC)方面前5 位分别是细胞外围、质膜、胞外区、细胞表面、质膜固有成分(图5A)；在下调基因的细胞组分方面前5 位分别是胞外区、囊泡、细胞外间隙、胞外体、细胞外小泡(图5B)。

图3 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的上调(A)和下调(B)差异基因参与的生物过程Fig.3 Biological processes of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes

图4 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的上调(A)和下调(B)差异基因的分子功能Fig.4 Molecular functions of up-regulated (A) and down-regulated (B) genes differentially expressed in nasal polyps and normal nasal mucosa

图5 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的上调(A)和下调(B)差异基因的细胞组分Fig.5 Cellular components of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa

3 差异表达基因的GO 富集分析和KEGG 信号通路富集分析 在上调差异基因中使用Metacore database 对其功能进行富集分析，前5 种信号通路分别为经典补体激活途径免疫反应、凝集素诱导补体途径免疫反应、嗜碱性粒细胞在哮喘中的迁移、重性抑郁症经典补体系统激活的可能途径、补体替代途径的免疫应答(图6A)。在下调差异基因的分析结果中，前5 种信号通路分别为哮喘气道平滑肌细胞肥大、泪腺中ACM3 信号的传递、肺癌中的G 蛋白偶联受体信号转导、神经内分泌肽的蛋白质折叠和成熟及其翻译后加工、成体干细胞向少突胶质细胞分化(图6B)。

图6 CRSwNP 组织与健康对照黏膜之间的上调(A)和下调(B)差异基因的Metacore 通路分析Fig.6 Metacore pathways of up-regulated (A) and down-regulated (B) differentially expressed genes in nasal polyps and normal nasal mucosa

4 蛋白-蛋白互作网络分析 选取校正后P＜ 0.05，差异倍数(FC) ≥ 5 或 ≤ 1/5 的166个差异表达基因，利用String 数据库(https://string-db.org)，在保留相互作用预测得分＞0.4 的作用对后共得到了236 对连接对，使用Cytoscape 软件对差异表达基因编码蛋白相互作用网络进行可视化展示(图7A)。通过插件MCODE 对蛋白互作网络进行分析，得出核心基因，SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP 在鼻息肉组织中表达上调，CHRDL1、BPIFB2 在鼻息肉组织中表达下调(图7B)。

图7 CRSwNP 相关的蛋白-蛋白相互作用网络(A)以及核心基因(B)：橙色表示上调差异基因，蓝色表示下调差异基因Fig.7 Protein-protein interaction networks in CRSwNP (A) and hub genes from the networks (B) :Orange indicates up-regulated genes and blue indicates down-regulated genes

讨 论

本研究通过对CRSwNP 鼻息肉组织和正常黏膜组织的转录组学数据分析研究，共筛选得到777个差异表达基因，其中上调基因527个，下调基因250个。对差异基因进行功能和通路富集分析，显示炎症反应、免疫受体活性、粒细胞趋化、金属肽酶活性等生物学功能在鼻息肉组织与正常黏膜组织之间存在显著相关性。进一步得到与CRSwNP 相关的核心基因SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP、CHRDL1、BPIFB2。以上核心基因中SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP 在鼻息肉组织中表达上调，CHRDL1、BPIFB2 在鼻息肉组织中表达下调。

SCG2 编码的蛋白质是神经内分泌蛋白的嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白家族的成员，在其产生的组织中被迅速切割成生物活性肽；而这些被切割的产物已被证实通过刺激VEGF 信号、MAPK 通路、PI3K/Akt 通路抑制内皮细胞凋亡、促进增殖、迁移和血管生成[8-9]；目前有关SCG2 基因的机制研究较少，有待进一步探索。IGFBP3 是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的成员，编码具有IGFBP 结构域和Ⅰ型甲状腺球蛋白结构域的蛋白质；研究发现其在子宫内膜的重塑过程发挥作用，但在炎症性疾病中暂缺研究[10]。CA4 是碳酸酐酶的一种，碳酸酐酶是一大类锌金属酶，可催化二氧化碳的可逆水合；其参与各种生物过程，包括呼吸、钙化、酸碱平衡、骨吸收以及房水、脑脊液、唾液和胃酸的形成；在小鼠哮喘模型的嗜酸性粒细胞中，CA4 的表达受IL-5 动力学调节[11]。补体C3 在补体系统的经典和替代激活途径中均起到核心作用；补体激活在维持宿主体内稳态方面很重要，但过度和不受控制的激活可能导致炎症和疾病，血清中C3 的升高可能在CRS 的发展中起调节作用[12-13]。SPP1 又称为骨桥蛋白，其编码的蛋白质参与破骨细胞附着于矿化的骨基质的过程，还参与炎症和免疫介导的疾病的发病机制，并调节宿主对感染的反应[14]；研究发现慢性鼻窦炎患者的鼻窦黏膜组织中SPP1 表达上调，上调过程被IFN-γ、IL-1β 和TNF-α 诱导，被IL-4 和IL-13 抑制，提示SPP1 可能在慢性鼻窦炎的发病机制中起重要作用[15]；另外，过敏性鼻炎患者血浆中SPP1 表达上调，与瘦素协同调节嗜酸性粒细胞的凋亡、黏附、迁移和激活[16]；SPP1 促进树突状细胞分泌IL-12[17]，同时在克氏锥虫感染过程中驱动IFN-γ、IL-17A 和IL-10 分泌[18]；SPP1 还可通过ERK 和P38/MAPK 激活增强中性粒细胞浸润，从而引起败血症诱发的急性肺损伤[19]；在慢性鼻窦炎的表型水平SPP1 的表达已得到验证，但其在疾病的发病过程中发挥的关键性作用仍有待进一步深入研究。CP 是一种金属蛋白，与血浆中的大部分铜结合，并参与Fe(Ⅱ)转铁蛋白向Fe(Ⅲ)转铁蛋白的过氧化反应；已有研究证明鼻息肉患者CP 水平高于正常对照[20]。CHRDL1 基因编码骨形态发生蛋白4 的拮抗剂，可以抑制羊水来源的间充质基质细胞的增殖和迁移[21]。BPIFB2 编码脂质转移/脂多糖结合蛋白基因家族的成员；在CRSwNP 中高通量测序及实时定量PCR 同样发现BPIFB2 表达显著下调，机制仍有待进一步探寻[22]。

综上所述，本研究基于生物信息学方法，对CRSwNP 患者鼻息肉组织与健康对照鼻黏膜的差异基因进行功能和通路富集分析，并对其潜在核心基因进行初步探索。若将本研究结论应用于临床CRSwNP 的诊疗中，后续仍需要进一步的实验验证。尽管如此，本研究依然有助于增强对CRSwNP 相关致病分子机制的了解，同时为该疾病的临床诊断与治疗提供了一定的研究基础。