布拉氏酵母菌益生性和功能性的体外评价

回 晶，白琦琦，杨 莹，张业崎

(辽宁大学 生命科学院，辽宁 沈阳 110036)

0 引言

益生菌是一类定殖于动物口腔、肠道或生殖道内，对宿主有益的活性微生物.益生菌既有细菌类又有真菌类，主要分为乳杆菌类、双歧杆菌类、链球菌类以及酵母菌类4种类型.益生菌应用十分广泛，在人类生活的方方面面都起着重要的作用，它既可以作为治疗腹泻的药物和促进肠道健康的保健食品，又可以作为畜禽饲料来提高动物生产性能.近年来，人们发现益生菌可替代抗生素且不产生副作用，其中双歧杆菌、嗜酸乳杆菌目前已被广泛使用，但它们的耐热性和抗逆性较差，在产品中更难以长时间存活，因此继续寻找新的益生菌菌株以满足实际的使用需要显得尤为重要.

不同于市面上大多数的益生菌，布拉氏酵母菌(S.Boulardii)是一种真菌类益生菌，该菌属于酿酒酵母益生菌的亚种，具有酿酒酵母益生菌特性的同时却比酿酒酵母益生菌具有更高的耐酸耐热性.布拉氏酵母菌作为微生态制剂的一种，具有天然、无毒副作用、安全可靠、无残留等多重优点，可与抗生素同时使用，并能有效预防抗生素滥用导致的肠道菌群失调[1].虽然布拉氏酵母菌具有十分广阔的应用前景，但人体环境十分苛刻，布拉氏酵母菌只有在胃胆环境中具备稳定的耐受能力，才能够在进入人体后顺利抵达肠道并发挥其功能，可见深入开展布拉氏酵母菌益生性和功能性的研究，对于其功能和安全的后续探究是不可缺少的前提.

1 材料与试剂

1.1 主要试剂

本文的主要试剂：胃蛋白酶、牛胆盐、无菌生理盐水、稀盐酸、胆固醇、冰乙酸、巯基乙酸钠、邻苯二甲醛、氢氧化钾、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、正己烷、铁氰化钾、浓硫酸、三氯化铁(FeCl3)、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚.

1.2 培养基

本文所用培养基如下：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)，MRS培养基，胆盐培养基和高胆固醇培养基.胆盐培养基的制备方法：取牛胆盐于液体培养基中，使胆盐浓度(g/mL)为0.3%、0.5%，121 ℃灭菌15 min，冷却备用；高胆固醇培养基的制备方法：向培养基中加入0.2%巯基乙酸钠、0.3%牛胆盐及100 μg/mL胆固醇.

1.3 仪器与设备

本文所使用的仪器为V7000D型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)和LC-RE-52AA旋转蒸发仪(上海力辰邦西仪器科技有限公司).

2 实验方法

2.1 耐模拟胃液实验

本实验取4.5 mL现配现用的模拟胃液与0.5 mL的布拉氏酵母菌悬液混合，37 ℃培养6 h，在培养过程中，分别于0、1、3和6 h无菌取出0.1 mL混合液并作适当稀释，30 ℃培养48 h，采用平板计数法测定活菌数[2]，计算存活率[3-4].

(1)

2.2 耐胆盐实验

本实验将布拉氏酵母菌悬液按3%的接种量接种于5 mL不同浓度的胆盐培养基中，于37 ℃培养6 h，在培养过程中，分别于0、3和6 h无菌取出培养液并作适当稀释，30 ℃培养48 h，测定活菌数[2]，计算存活率[5].

(2)

2.3 体外降胆固醇能力

本实验以胆固醇浓度(μg/mL)为横坐标，OD550为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线[6-7].通过邻苯二甲醛(OPA)法进行测定[8]胆固醇去除率，根据标准曲线计算样本中胆固醇含量.

(3)

式中：C0为未接种培养液离心上清液中胆固醇实测质量浓度，μg/mL；C为接种后发酵液离心上清液中胆固醇实测质量浓度，μg/mL.

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2.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

2.4.1 DPPH·清除率

本文参考Kandi[9]的方法，采用分光光度法[10-11]，将0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液与待测菌悬液按1∶1体积比混合，振荡，室温下暗反应30 min后，3 500 r/min离心10 min，收集上清液，于517 nm波长处测定上清液的吸光值，并以乙醇溶液调零，清除率按下式计算：

(4)

式中：Ai为1 mL待测菌悬液加1mL DPPH乙醇溶液的吸光值；Aj为1 mL待测菌悬液加1 mL无水乙醇的吸光值；Ac为1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)加1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值.

2.4.2 ·OH清除率

本文参考毕秋芸[12]的方法并略作改动[13]，测定羟自由基清除率.清除率按下式计算：

(5)

式中：Am为含有样品和H2O2的吸光值；An为不含样品但含H2O2的吸光值；A0为不含样品和H2O2的吸光值.

2.4.3 总还原力

本文参考林祥娜等[13]、黄丽等[14]的铁氰化钾法，向15 mL离心管中加入0.5 mL待测菌悬液，0.5 mL 1%铁氰化钾，0.5 mL 0.2 mol/L pH 6.8 PBS，充分混匀后，50 ℃保温20 min；迅速冷却后，加入0.5 mL 10% 三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白后，3 500 r/min离心10 min并收集上清液.取1 mL上清液，加入1 mL 0.1%的FeCl3溶液，于700 nm处测定吸光值，以抗坏血酸为标准品，测定总还原力.

本文参考何美书[15]的方法并略作改动[16]，测定超氧阴离子自由基清除率.清除率按下式计算：

(6)

式中：A11为含样品和邻苯三酚的吸光值；A10为含样品但不含邻苯三酚的吸光值；A01为不含样品但含邻苯三酚的吸光值；A00为不含样品和邻苯三酚的吸光值.

3 结果与讨论

3.1 耐模拟胃液实验

益生菌在抵达肠道环境之前，需要以活菌的形式通过胃部酸性环境，因此，益生菌在酸性胃液里仍需要有较高的存活率是发挥其功能的前提之一[17-18].在正常pH值下(见表1)，布拉氏酵母菌的存活率不低于100%，模拟胃液pH=4时(见表2)，布拉氏酵母菌几乎不受影响，能够很好存活.模拟胃液pH=3时(见表3)，随着时间的增加存活率略有降低，6 h后的存活率仍高达96.27%，优于对照组鼠李糖乳杆菌(LGG).因此可知，在模拟胃液实验中，布拉氏酵母菌的存活情况良好，能够耐受胃液环境.

表1 布拉氏酵母菌对空白模拟胃液的耐受能力

表2 布拉氏酵母菌对pH=4模拟胃液的耐受能力

表3 布拉氏酵母菌对pH=3模拟胃液的耐受能力

3.2 耐胆盐实验

正常情况下，人体肠道中胆盐浓度变化范围是0.03%～0.3%，益生菌只有能够抵抗胆盐的拮抗作用才有可能在肠道中定殖发挥益生作用[19-20].所设置的不加胆盐空白对照组环境下(见表4)，布拉氏酵母菌在6 h后存活率维持在100%左右.布拉氏酵母菌在0.3%浓度胆盐环境下(见表5)，布拉氏酵母菌生存受到影响，3 h存活率为89.98%，6 h存活率为78.15%，对照菌鼠李糖乳杆菌在作用了6 h后存活率为83.69%，与布拉氏酵母菌存活率相近.在0.5%浓度胆盐环境下(见表6)，布拉氏酵母菌在经过3 h的胆盐反应后，其活菌数量下降，存活率为78.55%，低于同等时长0.3%浓度胆盐实验，在0.5%浓度胆盐作用6 h时，已检测不到活菌.由此可知，布拉氏酵母菌对于0.3%浓度胆盐环境具有良好耐受能力，但对于0.5%的胆盐环境不具有耐受能力.

表4 布拉氏酵母菌对空白胆盐的耐受能力

表5 布拉氏酵母菌对0.3%浓度胆盐的耐受能力

表6 布拉氏酵母菌对0.5%浓度胆盐的耐受能力

3.3 布拉氏酵母菌对胆固醇的降解能力

在硫酸存在的条件下，由于胆固醇及其酯与邻苯二甲醛作用会产生紫红色的物质，该物质在550 nm有最大吸收值，因此可以用比色法测定胆固醇含量[21].由图1可知，布拉氏酵母菌的胆固醇清除率为25.05%，清除量为16.37 μg/mL，与对照的鼠李糖乳杆菌相比，布拉氏酵母菌的体外胆固醇清除率略低于鼠李糖乳杆菌，具有较好的胆固醇降解能力.

图1 布拉氏酵母菌对胆固醇的降解能力

3.4 布拉氏酵母菌的抗氧化能力

3.4.1 DPPH·清除能力

DPPH·是一种相对比较稳定的自由基，当DPPH溶液中加入抗氧化剂时DPPH·吸收能力将会减弱，DPPH·的清除能力经常用于评价物质抗氧化的能力[22-23].由图2(a)可以看出，布拉氏酵母菌在106～108CFU/mL均具有清除DPPH·的能力，且随着菌体浓度的增大，清除能力随之增强.与对照组相比，布拉氏酵母菌对DPPH·的清除能力比鼠李糖乳杆菌略低，但差异不大，仍有较好的清除DPPH·的能力.

3.4.2 ·OH清除能力

邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，它的颜色改变可反映溶液中氧化还原状态的变化.通过Feton反应体系，产生的·OH可使邻二氮菲水溶液氧化成邻二氮菲-Fe3+，通过测定536 nm处的吸光值变化反映系统中·OH的变化[24].由图2(b)可以看出，布拉氏酵母菌菌体浓度为106CFU/mL时，·OH的清除能力较弱，但当菌体浓度达到108CFU/mL时可达到41.26%，略低于鼠李糖乳杆菌，但差异不显著，具有较好的·OH清除能力.

3.4.3 总还原力

铁氰化钾在弱酸性的环境下能够还原生成黄血盐[K4Fe(CN)6]，之后再与FeCl3提供的Fe3+作用生成普鲁士蓝.还原能力的强弱常以普鲁士蓝的生成量为指标，通过测定其在700 nm处的吸光值(A700)的大小来判定物质的还原能力强弱[25].A700越大，其还原能力越大，还原能力是通过转化为抗坏血酸的量来表示的.结果如图2(c)所示，不同菌体浓度的总还原能力差异显著.随着菌体浓度增加，布拉氏酵母菌的还原能力比鼠李糖乳杆菌略强，当菌体浓度达到108CFU/mL时，布拉氏酵母菌转化为抗坏血酸的浓度高达25.79 μmol/L.由此可知，布拉氏酵母菌具有较强的还原能力.

图2 布拉氏酵母菌的抗氧化能力(不同小写字母代表布拉氏酵母菌菌体浓度对清除能力差异显著性；不同大写字母代表鼠李糖乳杆菌菌体浓度对清除能力差异显著性)