非核糖体七肽lipovelutibols A的固相合成

廖秀飞，莫金秋，刘泰容，唐 铭，廖洪利*

(1.成都医学院药学院，四川 成都 610500；2.塔里木大学医学院，新疆 阿拉尔 843300)

非核糖体多肽(nonribosomal peptide，NRP)是细菌和真菌等微生物经非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthase,NRPS)催化合成的次级代谢产物[1]，具有重要的生物活性和药理特性[2-5]。NRP通常呈环状和分支状结构，含有非天然氨基酸(如D型氨基酸)，NRP合成后会进一步被N-甲基化、N-甲酰基化、糖基化、乙酰化、卤化和羟基化等修饰以提高其结构或活性的多样性[3]。因其良好的药理活性，目前已有超过20种NRP类药物上市，如：抗菌药(青霉素、万古霉素)、抗肿瘤药(博来霉素)、免疫抑制剂(环孢菌素)[4]等。近年来，随着恶性肿瘤和多药耐药细菌感染的威胁日益严重，基于NRP开发新药来应对人类重大疾病的研究引起了众多学者的关注[3,5]。

lipopeptaibols是一类由腐生营养型真菌产生的NRP，典型结构特征为：1)分子长度一般在6～10个残基；2)N端有8～15个碳原子烷基化；3)C端羟基化；4)分子内含有较高比例的α，α-二烷基氨基酸，尤其是α-氨基异丁酸(Aib)、异缬氨酸(Iva)、3-乙基正缬氨酸(EtNva)及1-氨基环丙烷羧酸(Acc)等[6]，这些氨基酸有利于多肽的螺旋化[7]。因其结构的特殊性，相比于一般多肽，lipopeptaibols更容易穿透细胞膜，发挥抗菌作用[8]。喜马拉雅寒冷栖息地存在很多未被发现的微生物，Singh等[9]从该土壤的木霉属丝状变形真菌Trichodermavelutinum中分离得到4个新型lipopeptaibols，即lipovelutibols A～D，lipovelutibols由7个氨基酸残基组成，N端辛酰化，C端为亮氨醇，其结构通式为：octanoyl-Gly-Ala-Leu-Aib/DIva-Ser/Ala-Ile-leucinol。细胞实验表明，lipovelutibols对人白血病细胞HL-60、结肠癌细胞LS180、乳腺癌细胞MDA-MB-231和肺癌细胞A549等多个肿瘤细胞系均可达到微摩尔级的抑制毒性，具有潜在的临床应用价值。目前，国内外关于lipovelutibols的化学合成尚未见文献报道。作者采用Fmoc多肽固相合成法合成目标产物lipovelutibols A(图1)，为该类NRP的合成及进一步修饰提供研究思路。

1 实验

1.1 试剂与仪器

Fmoc-氨基酸、Wang-Leu-NHFmoc树脂，上海吉尔生化有限公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、硼氢化钠(NaBH4)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吗啉(NMM)、2-肟氰乙酸乙酯(ethyl cyanoglyoxylate-2-oxime，Oxyme)、氯甲基异丁酯、三氟乙酸(TFA)、乙腈(色谱纯)，北京百灵威科技有限公司；茚三酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、二氯甲烷(DCM)、哌啶、苯酚均为分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司。

气浴恒温振荡器，常州国宇仪器制造有限公司；LD5-2A型低速离心机，北京京立离心机有限公司；LC3000型高效液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司；Agilent 1260 Infinity型液相色谱仪、6538UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS质谱仪，美国Agilent公司。

1.2 方法

lipovelutibols A的合成路线见图2。

图2 lipovelutibols A的合成路线Fig.2 Synthetic route of lipovelutibols A

1.2.1 肽链的合成

取Wang-Leu-NHFmoc树脂500 mg(载样量为0.30 mmol·g-1)加入到固相合成反应管中，用DCM浸泡20 min使树脂充分溶胀，抽干待用。加入20%哌啶-DMF溶液(0.1 mol·L-1Oxyme)至树脂完全淹没，室温(25 ℃)下振荡5 min × 2脱去树脂上的Fmoc，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。将Fmoc-Ile-OH(297 mg，1 mmol)、Oxyme(142 mg，1 mmol)、DIC(155.0 μL，1 mmol)混溶于7 mL NMP，加入到树脂中，于60 ℃下振荡20 min，依次用DCM、DMF洗涤树脂各3次。随后根据多肽序列依次将Fmoc-氨基酸/正辛酸(1 mmol)、Oxyme(142 mg)、DIC(155 μL)混溶于7 mL NMP，加入到树脂中，于60 ℃下振荡20 min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。缩合反应中通过茚三酮-苯酚显色监测反应进程。

1.2.2 肽链的游离

肽链连接完成后，将树脂洗净抽干，加入三异丙基硅烷(TIPS)∶H2O∶TFA=1∶1∶38(体积比)15 mL，室温下振荡4 h，过滤，用少许TFA洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓泡吹走多余TFA，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃上清，继续用冰乙醚反复洗涤离心3次，氩气吹干待用，得还原前粗品104.6 mg。

1.2.3 C端 Leu羧基的还原

将还原前粗品溶于THF中，于-15 ℃下加入NMM(1 eq.)、氯甲酸异丁酯(1 eq.)，搅拌1 min；加入NaBH4/H2O(3 eq.)于-15 ℃下搅拌4 h后，水淬灭；用乙酸乙酯萃取有机层，无水Na2SO4干燥后浓缩，得lipovelutibols A粗品81.5 mg。

1.2.4 lipovelutibols A的分离纯化

将lipovelutibols A粗品用乙腈和水溶解，通过制备型RP-HPLC纯化。色谱条件： YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(250 mm×20 mm,5 μm)；检测波长214 nm；流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脱(0～60 min，流动相B：40%～90%)；流速15.0 mL·min-1。收集主峰，冷冻干燥后得白色粉末46.2 mg，总收率40.0%。

1.2.5 分析与表征

对还原前粗品进行HPLC分析，色谱条件：Waters Bridge C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm；4.6 mm×250 mm,5 μm)；检测波长214 nm；流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为0.1%TFA乙腈溶液，梯度洗脱(0～30 min，流动相B：5%～95%)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃。收集主峰，进行HR-Q-TOF-MS测试。

对lipovelutibols A纯品进行HPLC分析，色谱条件同上；并对lipovelutibols A纯品进行HR-Q-TOF-MS测试。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析(图3)

由图3可知，还原前粗品的保留时间为24.125min；lipovelutibols A纯品的保留时间为24.610 min，纯度大于98%。

图3 还原前粗品(a)及lipovelutibols A纯品(b)的HPLC图谱Fig.3 HPLC spectra of unreduced peptide(a) and pure lipovelutibols A(b)

2.2 质谱分析(图4)

还原前粗品的分子式为C38H69N7O10,分子量为784.01 Da；lipovelutibols A纯品的分子式为C38H71N7O9，分子量为770.03 Da。由图4可知，还原前粗品分子离子峰为[M+H]+=784.5168，[M+Na]+=806.4985(图4a)；lipovelutibols A纯品分子离子峰为[M+H]+=770.5394，[M+Na]+=792.5198(图4b)，还原前粗品、lipovelutibols A纯品的分子量均与理论值相符。

图4 还原前粗品(a)及lipovelutibols A纯品(b)的HR-Q-TOF-MS图谱Fig.4 HR-Q-TOF-MS spectra of unreduced peptide(a) and pure lipovelutibols A(b)

3 结论

采用Fmoc多肽固相合成法，以Wang-Leu-NHFmoc树脂为载体、Fmoc-Ile-OH为起始原料、DIC/Oxyme为缩合体系，按照lipovelutibols A的氨基酸序列由C端向N端依次偶联,肽链从树脂上切割下来后，经NaBH4、氯甲酸异丁酯在碱性条件下还原，再经制备型RP-HPLC纯化得lipovelutibols A，总收率40.0%。相比于液相合成法，固相合成法大大降低了每步产品纯化的难度，操作更简单适用，总收率高，适用于同类型非核糖体多肽的化学合成。