海洋来源小单孢菌Micromonospora sp. FIMYZ-25次级代谢产物研究∗

吴媛媛, 王克波, 苏海波, 张金坤, 吕华伟, 李行诺

(浙江工业大学药学院, 浙江 杭州 310014)

海洋小单孢菌由于生活在极端的海洋环境中(高盐、 高压、低温、 寡营养等), 其代谢途径独特, 形成的次级代谢产物在结构类型及生物活性方面具有多样性, 结构类型包括大环内酯类、 环肽类、 生物碱类, 生物活性包括抗菌[1]、 抗肿瘤[2]、 抗锥虫[3]等。 多种已用于临床的抗生素如罗米沙星、 庆大霉素等均从小单孢菌中分离得到。 这些化学成分的发现在海洋药物的开发中显示了良好的前景[4]。 为了从海洋小单孢菌次级代谢产物中发倔具有活性的药用先导化合物, 本文对海洋来源的小单孢菌Micromonosporasp. FIMYZ-25 的固体发酵产物进行系统的化学成分研究, 从中分离得到12 个单体化合物, 并以抗菌活性筛选模型对化合物进行抗菌活性初步评价。

1 材料、 仪器与试剂

1.1 材 料

菌株分离自台湾海峡的海泥样品, 经16S rDNA 序列比对及形态学分析分析鉴定为Micromonosporasp.。 菌种保存于福建微生物研究所。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪, 安捷伦科技有限公司核磁共振仪,Bruker 公司质谱仪, 安捷伦科技有限公司高压蒸汽灭菌锅, 上海博讯实业有限公司旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂超声清洗仪, 昆山市超声仪器有限公司恒温摇床, 太仓市实验设备厂恒温培养箱, 太仓市实验设备厂。

反向色谱柱填料(ODS, 日本YMC 公司MCI 填料日本三菱公司柱层析硅胶和薄层层析硅胶板(GF 254, 烟台江友硅胶开发有限公司葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20, 美国GE Healthcare 公司石油醚、 二氯甲烷、 乙酸乙酯)分析纯, 国药化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株发酵

将菌株接种至固体平板培养基上, 于28 ℃恒温培养箱中培养3 d; 挑取适量单菌落接种至种子培养基(可溶性淀粉15 g、葡萄糖 5 g、 蛋白胨(肉胨)5 g、 酵母粉 5 g、 (NH4)2SO40.5 g、K2HPO40.5 g、 NaCl 0.5 g、 MgSO4·7 H2O 0.5 g、 CaCO31 g,水补至1 L, pH 7.2。)中, 于28 ℃, 200 r/min 条件下培养4 d,作为种子液; 将种子液按5%接种量接种至装有大米培养基(大米320 g, 水400 mL)的2 L 锥形瓶中, 共接种50 瓶, 在28 ℃的条件下静置培养28 d, 得到发酵物。

图1 化合物1-12 的结构式Fig.1 Structures of compounds 1-12

1.3.2 提取与分离

将发酵物充分捣碎, 加入等体积的乙酸乙酯超声提取3 次,每次15 min, 合并乙酸乙酯提取液, 减压浓缩后得粗浸膏7.9 g。

粗浸膏用MCI 柱色谱分离, 以甲醇-水(0 ~100%)为洗脱剂, 得到6 个组分(Fr. 1-Fr. 6)。 Fr. 2(0.8 g)经 Sephadex LH-20(甲醇)柱层析, 得到5 个组分(Fr. 2.1-Fr. 2.5), Fr. 2.2用prep-HPLC(甲醇-水15∶85,v/v)分离得到化合物1(4.3 mg)。

Fr.3(1.08 g)经硅胶柱色谱梯度洗脱, 洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(100∶1、 80∶1、 30∶1、 9∶1), 得到 5 个组分(Fr.3.1 ~Fr.3.5), Fr.3.1(70 mg)经prep-HPLC(甲醇水20∶ 80,v/v)制备得到化合物2(7.5 mg)。 Fr.3.2(35 mg)经prep-HPLC(甲醇-水28 ∶72,v/v)制备得到化合物3(2.5 mg)和化合物4(2.0 mg); Fr.3.3(50 mg)经prep-HPLC(甲醇-水38∶ 62,v/v)制备得到化合物5(12.0 mg)和化合物6(4.0 mg); Fr.3.4(105 mg)经硅胶柱色谱梯度洗脱, 洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(150 ∶ 1、 80 ∶ 1、 50 ∶ 1、 9 ∶ 1), 合 并 得 到 5 个 组 分(Fr.3.4.1-Fr.3.4.5), Fr. 3.4.4(70 mg)用prep-HPLC(甲醇-水30∶70,v/v)制备得到化合物7(11.5 mg)、 化合物8(2.6 mg)和化合物9(3.9 mg)。

Fr.4(1.2 g)经硅胶柱色谱梯度洗脱, 洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(200∶ 1、 100∶ 1、 50∶ 1、 9∶ 1), 合并得到 4 个组分(Fr. 4.1-Fr. 4.4), Fr. 4.2 用分析型HPLC(甲醇-水35∶65,v/v)分离纯化得到化合物10(1.8 mg), 化合物11(3.0 mg)和化合物12(2.7 mg)。

1.3.3 抗菌活性评价

对所得到的单体化合物采用微量肉汤稀释法测定抑菌效果, 以革兰氏阳性菌(屎肠球菌E.FaeciumATCC19434、 枯草芽孢杆菌B.subtilis168、 金黄色葡萄球菌S.aureusATCC25923、粪肠杆菌E.faecalisFA2-2)和革兰氏阴性菌(幽门螺旋杆菌H.pylori26695、 大肠杆菌E.coliMG1655、 铜绿假单胞杆菌P.aeruginosaPAO1、 鲍曼不动杆菌A.baumanniiATCC 19606)作为指示菌株。 将上述指示菌株分别用接种环挑适量以上菌株的单菌落于10 mL MH 液体培养基中, 以180 r/min, 28 ℃条件于摇床中进行振荡培养, 振荡12 将菌液配制成浓度为2×105CFU/mL的菌悬液备用。 称取适量的待测单体化合物, 以DMSO 为溶剂配制成初浓度为16 μg/mL 的溶液, 用等倍稀释法分别配制药物浓度为 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25、 0.125 μg/mL, 第 9 孔不加药, 作为加菌不加药对照。 将96 孔平板放置于37 培养箱中进行培养, 24 h 后观察菌液的清浊度判断其抑菌效果。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构鉴定

化合物 1: 白色粉末, ESI-MSm/z210.17[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δH9.09(1H, NH), 7.30(1H, d,J=7.7 Hz, H-2), 6.93(1H, d,J=7.4 Hz, H-3), 6.69(1H, d,J=7.7 Hz, H-4), 3.91(2H, s, H-9);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δC171.3(C-10), 169.4(C-7), 149.4(C-6), 146.3(C-5), 118.8(C-4), 118.0(C-3), 117.6(C-2), 115.4(C-1), 41.6(C-9)。 上述数据与文献[5]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为2, 3-二羟基苯甲酰基-N-甘氨酸。

化合物 2: 白色粉末, ESI-MSm/z135.15 [M-H]-。1H NMR(CDCl3, 600 MHz) δH7.32 ~ 7.38(3H, dt,J= 7.8,3.4Hz, H-5, 6, 7), 7.40 ~ 7.5(2H, m, H-4, 8), 3.71(2H, s, H-2);13C NMR(CDCl3, 150 MHz) δC178.4(C-1),133.5(C-3), 133.4(C-4), 129.5(C-5), 129.4(C-7),128.6(C-8), 127.3(C-6), 41.2(C-2)。 上述数据与文献[6]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为苯乙酸。

化合物 3: 白色粉末, ESI-MSm/z200.18 [M-H]-。1H NMR(CD3OD, 400 MHz) δH8.30(1H, s, H-2), 8.18(1H,s, H-4), 5.96(1H, d,J=6.6 Hz, H-1′), 4.70(2H, m, H-2′), 4.32(1H, dd,J=4.8, 2.4 Hz, H-3′), 4.17(1H, q,H-4′), 3.88(1H, dd,J=12.6, 2.4 Hz, H-5′a), 3.75(1H,dd,J=12.6, 2.4 Hz, H-5′b);13C NMR(CD3OD, 100 MHz)δC142.0(C-2), 153.5(C-4), 88.2(C-1′), 75.5(C-2′),72.7(C-3′), 91.3(C-4′), 63.5(C-5′)。 上述数据与文献[7]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为1-(β-D-呋喃核糖)-1H-1,2,4-三氮唑。

化合物 4: 白色粉末, ESI-MSm/z203.23 [M-H]-。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δH2.62(1H, dd,J=16.0 Hz, H-6a), 2.99(1H, dd,J= 13.5, 4.5 Hz, H-7a), 3.24(1H,dd,J=16.0 Hz, H-7b), 3.42(1H, dd,J=13.5, 4.5 Hz, H-6b), 4.23(1H, m, H-3), 7.18 ~7.35(5H, m, H-9 ~13),7.91(1H, br, 1 - NH), 8.26 (1H, br, 4 - NH);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δC170.0(C-2), 168.6(C-5), 136.4(C-8), 131.4(C-10, 12), 129.6(C-9, 13), 128.4(C-11),57.5(C-3), 44.7(C-6), 40.87(C-7)。 上述数据与文献[8]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为环(甘-D-苯丙)二肽。

化合物5: 黄色油状物, ESI-MSm/z201.26 [M-H]-。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δH8.14(1H, br, 9-NH), 7.60(1H,d,J=8.0 Hz, H-4), 7.38(1H, d,J=8.0 Hz, H-7), 7.20(1H, dd,J=8.0, 8.0 Hz, H-6), 7.12(1H, dd,J=8.0,8.0 Hz, H-5), 7.04(1H, d,J=2.2 Hz, H-2), 3.61(2H,dt,J=6.5, 6 Hz, H-11), 2.98(2H, td,J=6.5 Hz, H-10),5.53(1H, s, 12 - NH), 1.92 (3H, s, H - 14);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δC170.0(C-13), 136.4(C-8), 127.3(C-9), 122.2(C-6), 122.0(C-2), 119.5(C-5), 118.7(C-4),113.1(C-3), 111.2(C-7), 39.8(C-11), 25.3(C-10), 23.4(C-14)。 上述数据与文献[9]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为N-乙酰基色胺。

化合物 6: 白色粉末, ESI-MSm/z193.19[M-H]-。1H NMR(CD3OD, 400 MHz) δH3.87(3H, s, 3-OCH3), 7.16(1H, d,J=1.5 Hz, H-2), 7.04(1H, dd,J=1.5, 8.0 Hz,H-6), 6.79(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 7.54(1H, d,J=16.0 Hz, H-7), 6.30(1H, d,J=16.0 Hz, H-8);13C NMR(CD3OD, 100 MHz) δC150.2(C-4), 149.3(C-3), 145.7(C-7), 128.2(C-1), 123.7(C-6), 117.6(C-5), 116.4(C-2),111.6(C-8), 169.6(C-9), 56.4(C-2′)。 上述数据与文献[10]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为阿魏酸。

化合物 7: 白色粉末, ESI-MSm/z225.23[M-H]-。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δH3.99(2H, dt,J=8.0, 4.0 Hz, H-2, 2′), 1.83(4H, m, H-3, 3′), 1.63(2H, m , H-4, 4′),8.16(2H, s, NH), 0.99(12H, dd,J=4.0 Hz, 4CH3);13CNMR(CDCl3, 100 MHz), δC169.2(C-1, 1′), 53.5(C-2,2′), 43.7(C-3, 3′), 24.4(C-4, 4′), 23.4(C-5, 5′), 21.3(C-6, 6′)。 上述数据与文献[11]中的基本一致, 鉴定该化合物为环(亮-亮)二肽。

化合物 8: 白色粉末, ESI-MSm/z215.24[M-H]-。1H NMR(CD3OD, 400 MHz) δH8.26(1H, m, H-2), 8.23(1H,m,J=7.6 Hz, H-4), 7.46(1H, m,J=7.8 Hz, H-7), 7.22(1H, td,J=7.7 Hz, H-5), 7.20(1H, td,J=7.7 Hz, H-6), 4.60(2H, s,J=7.6 Hz, CH2-2′), 2.09(3H, s, CH3-5′);13C-NMR(CD3OD, 100 MHz), δC191.9(C-1′), 173.7(C-4′), 138.3(C-7a), 134.3(C-2), 126.9(C-3a), 124.4(C-6), 123.3(C-5), 122.7(C-4), 115.8(C-3), 113.0(C-7), 47.1(C-2′), 22.5(C-5′)。 上述数据与文献[12]中的基本一致, 鉴定该化合物为N-乙酰基-β-氧色胺。

化合物 9: 白色粉末, ESI-MSm/z178.22[M-H]-。1H NMR(CD3OD, 600 MHz) δH7.0(2H, d,J=8.5 Hz, H-2′,6′), 6.71(2H, d,J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 3.33(2H, t,J=7.5 Hz, H-1), 2.69(2H, t,J=7.5 Hz, H-2), 1.89(3H,s, H-CH3);13C NMR(CD3OD, 150 MHz) δC173.2(C=O),157.0(C-4), 131.2(C-1), 130.9(C-2, 6), 116.2(C-3,5), 42.4(C-8), 36.5(C-7), 22.5(C-9)。 上述数据与文献[13]中的基本一致, 鉴定该化合物为N-乙酰基酪胺。

化合物10: 白色粉末, ESI-MSm/z167.19[M-H]-。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δH6.89(3H, m, H-2, 5, 6), 4.63(2H, s, H-7), 3.89(6H, s, H-8, 9);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δC133.7(C-1), 110.5(C-2), 149.1(C-3), 148.6(C-4), 111.1(C-5), 119.4(C-6), 65.2(C-7), 56.0(C-8), 55.9(C-9)。 上述数据与文献[14]中的基本一致, 鉴定该化合物为3,4-二甲氧基苯甲醇。

化合物11: 白色粉末, ESI-MSm/z259.29[M-H]-。1H NMR(CD3OD, 600 MHz) δH7.07(2H, d,J=9.0 Hz, H-2′,6′), 6.74(2H, d,J=9.0 Hz, H-3′, 5′), 4.40(1H, td, H-9), 4.09(1H, m,J=7.5 Hz, H-6), 3.59(1H, m, H-3a),3.39(1H, m, H-3b), 3.10(2H, dd,J=4.8, 17.3 Hz, H-10), 2.13(1H, m, H-5a), 1.84(2H, m, H-4), 1.27(1H,m, H-5b);13C NMR(CD3OD, 150 MHz) δC170.8(C-7),166.7(C-1), 157.7(C-4′), 127.6(C-1′), 132.1(C-2′,6′), 116.9(C-3′, 5′), 60.1(C-6), 57.9(C-9), 45.9(C-3), 37.7(C-10), 29.4(C-5), 22.7(C-4)。 上述数据与文献[15]中的基本一致, 鉴定该化合物为环(L-脯-L-酪)二肽。

化合物12: 白色粉末, ESI-MSm/z259.29[M-H]-。1H NMR(CD3OD, 600 MHz) δH7.34 ~7.23(5H, m, H-Ar-2′ ~6′), 4.52(1H, t,J= 4.9 Hz, H-9), 4.40(1H, dd,J=11.6, 4.1 Hz, H-6), 4.31(1H, t,J=4.7 Hz, H-4), 3.74(2H, dd,J=13.0, 5.1 Hz, H-3), 3.35(2H, m, H-10),2.10(2H, dd,J=13.5, 5.9 Hz, H-5);13C NMR(CD3OD,150 MHz) δC171.3(C-1), 167.1(C-7), 137.4(C-1′),131.0(C-2′, 6′), 129.5(C-3′, 5′), 128.1(C-4′), 68.5(C-4), 58.3(C-6), 57.6(C-9), 55.2(C-3), 38.9(C-5),38.0(C-10)。 上述数据与文献[16]中的数据基本一致, 鉴定该化合物为环(4-羟基-脯-苯丙)二肽。

2.2 抗菌活性筛选结果

抗菌结果显示化合物1-12 的MIC 值均大于16 μg/mL, 化合物1-12 对所测试菌株均未表现出明显的抑制作用。

3 结 论

从小单孢菌Micromonosporasp.FIMYZ-25 中分离得到12 个化合物, 其中有4 个环二肽类化合物分别是环(甘-D-苯丙)二肽(4), 环(L-亮-L-亮)二肽(7), 环(L-酪-L-脯)二肽(11),环(4-羟基-脯-苯丙)二肽(12)。 2 个吲哚类化合物N-乙酰基色胺(5),N-乙酰基-β-氧色胺(8), 以及2,3-二羟基苯甲酰基-N-甘氨酸(1), 苯乙酸(2), 1-(β-D-呋喃核糖)-1H-1,2,4-三氮唑(3), 阿魏酸(6), 3,4-二甲氧基苄醇(10)。 其中化合物 1、 3、 6 和 10 为首次从Micromonosporasp.FIMYZ-25 菌株中分离得到。 对12 个化合物进行抗菌活性筛选, 但均未显示明显的抗菌活性。