125I粒子照射通过PI3K/AKT信号通路抑制肝外胆管癌QBC939细胞增殖并诱导凋亡

瞿康林,周 帅,庞 青,李进昂,陈石磊,胡小四,张懿刚,金 浩,朱 超,王 勇,刘会春,(蚌埠医学院第一附属医院肝胆外科,蚌埠 33000;安徽省第二人民医院普外四科;通讯作者,E-mail:liuhcdoctor@6.com)

胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞的癌症,根据其解剖位置分为肝内胆管癌(iCCA)、肝门周围胆管癌(pCCA)和远端胆管癌(dCCA)[1,2]。越来越多的研究表明,近年来胆管癌总体发病率和死亡率呈上升趋势[3],治疗选择因其侵袭性而受到限制,胆管癌常常在晚期才被诊断出来,因此根治性切除手术受到了限制[4]。需要注意的是,肝肾综合征和进行性肝功能衰竭等严重的术后并发症可能与根治性切除有关。寻找抑制胆管癌细胞增殖、侵袭的有效方法,也显得格外重要。尽管胆管癌发生发展的确切机制尚未完全被证明,但持续的研究表明,PI3K/AKT通路的异常激活与包括胆管癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[5]。于是阻断这条信号通路也就成为许多肿瘤治疗的理论基础。

125I粒子近距离照射疗法在20世纪70年代首次用于治疗前列腺癌[6]。125I粒子可近距离持续向肿瘤组织释放很大剂量的γ射线,从而杀灭或抑制肿瘤细胞的生长[7]。胆管癌的恶性程度高、发病隐匿、诊治困难,虽然外科根治性切除术为目前临床治疗胆管癌的首选,但患者术后预后较差,所以寻找抑制胆管癌细胞增殖、侵袭的有效药物,是目前临床亟待解决的主要问题。125I粒子具有体积小、能量低的特点,连续低剂量率照射能抑制肿瘤细胞的有丝分裂,使肿瘤组织的再增生明显减少,同时对正常组织无损伤、毒副作用小[8]。125I粒子植入疗法目前广泛用于胸部、头颈、腹部以及软腔组织恶性肿瘤的临床治疗,并且取得了良好的疗效。125I粒子植入仍可用于放疗失败或复发的肿瘤患者,从而改善预后[9-12]。然而125I粒子对胆管癌的治疗机制尚不完全明确。本研究聚焦于植入不同数量的125I粒子,观察其对肝外胆管癌QBC939细胞的增殖和凋亡的影响,探索其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

主要仪器:1300-A2型生物安全柜(美国Thermo Electronic公司),L400型低速离心机(湖南湘仪仪器有限公司),TGL-20M型高速冷冻离心机(湖南湘仪仪器有限公司),Infinite F50型酶标仪(Tecan公司),BD FACSCanto型流式细胞仪(美国BD公司),IVIS Lumina Ⅲ型活体成像仪(美国perkinelmer公司),3111型CO2培养箱(美国Thermo Electronic公司)、肝外胆管癌QBC939细胞(上海吉凯基因公司,中国),胎牛血清,0.25%胰酶(Biomiky),Lip3000(Gibco)。125I粒子(原子高科股份有限公司,中国),MSI-125型密籽源,粒子长4.5 mm,直径0.8 mm,放射性活度为33.3 MBq,0 MBq(空源粒子),半衰期59.43 d,主要放射线为31.4/27.4 keV的X射线,35.5 keV的γ射线。

1.2 实验动物和细胞株

4周龄雌性BALB/c裸鼠30只,购于上海灵畅生物科技有限公司,饲养于SPF条件下。人肝外胆管癌细胞系(QBC-939)购自中国上海吉凯基因公司。人肝外胆管癌QBC939细胞利用RPMI-1640培养基(Gibco公司)、10%胎牛血清(四季青公司)和1%青-链霉素(Biosharp公司)的混合培养基培养,并在培养环境37.5 ℃和5%CO2培养箱培养。

1.3 实验分组

根据对QBC939处理的125I粒子梯度进行分组:0个粒子组(control组),1个失效粒子组(SX组),1个有效粒子组(LZ1组),2个有效粒子组(LZ2组),3个有效粒子组(LZ3组)。

1.4 集落形成实验检测细胞增殖

对数生长期QBC939细胞用胰酶消化后,以1 000个/孔接种于6孔板中,根据分组并分别加入0个粒子(control),1个失效粒子(SX),1个有效粒子(LZ1),2个有效粒子(LZ2),3个有效粒子(LZ3)。持续更换新鲜的培养基培养10～14 d让细胞形成集落。在显微镜下观察到出现明显的克隆集落时终止培养,弃去培养液。培养结束后,细胞用磷酸盐缓冲液洗涤,并用4%多聚甲醛溶液固定15 min,再以1%结晶紫试液染色20 min。用显微镜观察细胞增殖形成的集落数量。

1.5 CCK-8实验检测细胞增殖

将不同组别的125I粒子放入到具有密度为1×105的6孔板中,待照射48 h后,取各个组别的对数生长期QBC939细胞消化离心后,以5 000个/孔的密度接种到96孔培养板中。继续培养细胞24,48,72 h。每孔加入10 μl CCK-8试剂液(Beyotime Biotechnology公司),37.5 ℃温箱孵育2 h。利用酶标仪来测量450 nm处的吸光度。

1.6 双染法检测细胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒(碧云天公司)来评估细胞的凋亡情况。准备六孔板,每孔接种3×105个QBC939细胞,于CO2培养箱培养至贴壁后,将其分为5组:control组、SX组、LZ1组LZ2组和LZ3组。各组别分别加入相应粒子后分别培养48 h后,按照Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行处理,随后利用流式细胞仪检测。

1.7 Western blotting检测细胞PI3K/AKT信号通路中关键蛋白

我们用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液(碧云天公司)分别从各组细胞样品中提取其总蛋白。再使用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天公司)来测定其蛋白浓度。将蛋白样本采用SDS-PAGE凝胶电泳,然后转移到PVDF膜上。用牛奶封闭液封闭,然后分别加入GAPDH、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、MDM2的一抗(1 ∶1 000)于4 ℃冰箱过夜;次日用TPBS洗膜后再将其放入二抗(1 ∶500),在室温下置于摇床上孵2 h,TPBS洗膜后用化学发光试剂(ECL)显色,数字化多功能图像增强化学发光系统曝片,观察结果并进行分析。

1.8 裸鼠成瘤观察体内情况

30只BALB/c裸鼠随机分为control组、SX组、LZ1组、LZ2组和LZ3组,每组6只。收集1.4中各组处于对数生长期的QBC939细胞。再皮下注射到雌性BALB/c裸鼠的左前侧腋下,继续饲养,从第8天开始每3 d收集一次数据(裸鼠质量、瘤体长短径),连续观察21 d,断颈法处死裸鼠,剥取瘤体,测量瘤体大小并称重。肿瘤体积(mm3)=长径×短径2/2。使用电子天平称量肿瘤,并计算肿瘤生长曲线。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 125I粒子抑制QBC939细胞的增殖和活力

集落形成实验的结果表明,相较于空白对照组(control组),SX组的集落无明显变化,而LZ1组、LZ2组和LZ3组细胞所形成的集落数量都显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05,见图1),而LZ1组与LZ2组和LZ2与LZ3组均具有统计学差异,且随着粒子数目增加呈现递减趋势(见图1)。与之一致的是,CCK-8实验测得的OD值结果也显示:与control组比较,SX组无明显变化,而LZ1组、LZ2组和LZ3组显著下降(P<0.05,见图1)。

与control组相比，*P<0.05；与LZ1组相比，#P<0.05；与LZ2组相比，△P<0.05图1 125I粒子对QBC939细胞增殖的影响Figure 1 Effect of 125I seed on QBC939 cell proliferation

2.2 125I粒子诱导细胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法分析125I粒子照射对细胞凋亡的影响。其中control组和SX组差异无统计学意义，与control组相比较，LZ1组、LZ2组和LZ3组的早期和晚期凋亡率增加，且呈放射梯度依赖性(P<0.05，见图2)。这些结果表明125I粒子照射可能诱导了肝外管癌QBC939细胞的凋亡。

与control组相比，*P<0.05；与LZ1组相比，#P<0.05；与LZ2组相比，△P<0.05图2 125I粒子对QBC939细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of 125I seed on the apoptosis of QBC939

2.3 125I粒子抑制PI3K/AKT信号通路蛋白

利用Western blot法检测不同组别接受125I粒子照射72 h后的PI3K/AKT信号轴通路中关键蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和MDM2的表达水平,使用Image J 1.8.0软件对曝光结果各组灰度值进行处理并计算其相对表达量,结果显示,与control组相比,SX组无明显变化,而LZ1组、LZ2组和LZ3组细胞中信号蛋白AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、MDM2蛋白水平明显降低(P<0.05,见图3)。

与control组相比，*P<0.05图3 Western blot检测不同组别中PI3K/AKT信号轴的关键蛋白含量Figure 3 Key protein expression of PI3K/AKT signal axis in different groups detected by Western blot

2.4 125I粒子在体内抑制肿瘤生长

待裸鼠皮下瘤体生长21 d后,处死取出瘤体称重,control组、SX组、LZ1组、LZ2组和LZ3组分别为(1.28±0.159)g,(0.953±0.177)g,(0.169±0.132)g,(0.118±0.078)g,(0.018±0.013)g,与对照组比较,SX组肿瘤质量无明显变化,而LZ1组、LZ2组和LZ3组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。与control组相比,经过LZ1组、LZ2组和LZ3组肿瘤的生长速度变慢并逐渐下降,小鼠的肿瘤大小和肿瘤质量显着降低,其差异有统计学意义(P<0.05),而SX组变化不明显。以上结果表明,125I粒子可以抑制裸鼠的体内肿瘤进展。

与control组相比，*P<0.05；与LZ1组相比，#P<0.05；与LZ2组相比，△P<0.05图4 125I粒子抑制裸鼠皮下种植瘤生长Figure 4 125I seed inhibits the growth of subcutaneous xenograft tumor in nude mice

3 讨论

胆管癌是一种由多种上皮肿瘤组成的疾病实体,具有胆管细胞分化的特征,胆管癌按解剖位置分为肝内胆管癌(iCCA)、肝门周围胆管癌(pCCA)和远端胆管癌(dCCA)。这3种亚型的主要治疗方法依然是手术切除,新辅助放化疗后的肝移植只适合于一部分早期pCCA患者。此外,放射治疗的改进也促进了胆管癌的治疗[14]。而放射性粒子的植入是近距离放射治疗的有效形式[15]。因此探索其治疗胆管癌的分子机制就显得很有必要。

有限的临床治疗选择对于肝外胆管癌患者来说仍然是一个严峻的挑战,特别是对晚期患者[16]。125I粒子近距离照射疗法在20世纪70年代首次用于治疗前列腺癌[6]。125I粒子是一种疗效好,并且对周围的正常组织损伤小的人工合成的放射源。操作起来简单,对医护人员及和病患密切接触者损伤小。125I粒子包裹在金属外壳内,对于靶区来说能获得较高的辐射剂量,但是靶区周围的正常组织接受的很低,因此正常组织得到了保护,术后恢复更快[17]。将125I粒子制成颗粒源,可以通过CT或超声的引导从而植入肿瘤。125I粒子可近距离持续向肿瘤组织释放很大剂量的γ射线,从而杀灭或抑制肿瘤细胞的生长[7]。由于125I粒子照射的疗效高,并发症发生率低,因而常常被用于治疗各种不可切除、难以切除和/或局部复发类型的恶性肿瘤,包括恶性胶质瘤、非小细胞肺癌等[18]。在治疗胆管癌时,肿瘤组织生长会受到125I粒子的抑制,同时内皮细胞增殖也会被抑制。研究还表明,胆管支架联合粒子治疗恶性梗阻性黄疸有效且安全,支架的通畅性和患者的生存率都将得到提高[19]。我们前期的临床研究表明125I粒子对胆管癌有很好的治疗效果,对无法切除的胆管癌利用PTBS和125I粒子联合治疗,显著地缓解了症状,同时也改善了肝功能[20]。同时本团队发现,经皮胆道支架腔内近距离放疗与姑息性手术治疗肝外胆管癌的比较,前者显著改善了结果,并且可能是晚期EHCC的一种安全有效的治疗方法[21]。然而125I粒子放射治疗的机制仍然不完全清楚。细胞凋亡和细胞周期停滞可能在连续低能125I照射的治疗效果中起重要作用。然而,关于这一主题的综合证据,尤其是在分子水平上,仍然缺乏。在本研究中,我们评估了125I粒子对胆管癌QBC939细胞的影响及其机制,我们通过用不同数目的125I粒子去处理QBC939细胞,再利用集落形成实验、CCK-8法、双染法测细胞凋亡实验等发现125I粒子照射可以明显抑制肝外胆管癌QBC939细胞的增殖,并且促进其凋亡。

PI3K/AKT通路在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色,包括细胞活力、自噬、迁移、转移、血管生成和耐药性[22]。AKT是PI3K的关键下游激酶,AKT通路的激活是肺癌、乳腺癌和胃癌等多种癌症中细胞增殖、生长、存活和血管生成的主要介质[23,24]。而据Schuurbiers等[25]报道,p-Akt通过调节促凋亡蛋白表达而起到促进凋亡的作用。而当癌细胞暴露在辐射下后,常出现激酶激活的情况。例如,在结直肠癌中,125I粒子诱导细胞凋亡可能是基于其激活了PI3K/AKT信号通路等多种通路[13]。所以我们对125I在胆管癌中是否有类似作用感到好奇。在本研究中,为了深入了解125I粒子的作用机制,我们评估了相关分子蛋白的表达,结果显示,QBC939细胞经过125I粒子处理过后,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MDM2蛋白水平的表达被明显抑制,这表明了125I粒子的照射参与影响了肝外胆管癌QBC939细胞中该信号通路的活性。在很多种恶性肿瘤中,PI3K/AKT通路过度活跃,也正因此肿瘤细胞的增殖活性增强[26,27]。

我们进一步研究了QBC939细胞经过125I粒子处理过后,其凋亡情况的变化。利用膜联蛋白V-FITC/PI染色的流式细胞术分析证实了QBC939细胞凋亡增加,我们的数据表明125I粒子可能通过抑制PI3K/AKT/MDM2途径控制胆管癌细胞存活,并在促进细胞凋亡中发挥重要作用。

总体而言,研究结果表明,125I粒子在体内和体外抑制肝外胆管癌QBC939细胞的增殖并诱导其凋亡。此外,PI3K/AKT通路参与了125I粒子诱导QBC939细胞凋亡。因此,本研究为125I粒子治疗胆管癌及其机制提供了些许证据。