伏立康唑对HEK-293细胞中快速延迟整流钾通道及电压门控钠通道表达和功能的影响

宁菲菲,罗 玲,吴 燕,王 娅,马爱群,,,王亭忠,,(西安交通大学第一附属医院心内科,西安 7006;教育部环境与基因相关疾病重点实验室;陕西省心脏病学重点实验室;通讯作者,E-mail:tingzhong.wang@xjtu.edu.cn)

伏立康唑(voriconazole)是一种三唑类抗真菌药物,通过抑制14α-甾醇去甲基化,抑制真菌细胞膜的合成,具有抗菌谱广、抗菌效力强、口服生物利用度高等特点。伏立康唑主要用于治疗免疫功能低下所致的严重侵袭性真菌感染,是治疗肺曲霉菌感染的一线用药[1]。近年来,由于造血干细胞移植、实体器官移植在临床工作中广泛开展,免疫抑制剂、免疫调节剂在移植术后患者、风湿性疾病及肾脏疾病患者中大量使用,导致侵袭性曲霉菌、念珠菌等真菌感染风险提高,伏立康唑在临床中的应用逐渐增加[2]。随着用药人群的增加及用药疗程的延长,关于伏立康唑不良反应的报道不断增加[3-5]。近年来研究发现伏立康唑可导致QT间期延长、尖端扭转性室速、窦性心动过缓、心房颤动、房室传导阻滞等多种类型的心律失常,其发生机制尚不明确,也缺乏针对性的预防及治疗措施[6,7]。因此,了解伏立康唑导致心律失常发生的可能分子机制,有助于为预防和治疗伏立康唑相关心律失常提供可能的干预靶点。

多种遗传性或获得性因素均可能通过影响心肌细胞的离子流而延长动作电位时程(action potential duration,APD),表现为体表心电图上的QT间期延长,进而导致尖端扭转性室速等严重心律失常。既往研究发现,多种药物可以通过抑制心脏快速延迟整流钾通道(human ether-a-go-go-related gene,hERG,KCNH2编码)介导的快速延迟整流钾电流(the rapidly activating delayed rectifier potassium channel current,IKr)延长动作电位平台期,从而导致APD及QT间期延长[8,9]。心脏电压门控钠通道(Nav1.5,SCN5A基因编码)介导的钠电流(INa)是心肌细胞动作电位0期的主要内向电流,在心脏动作电位的形成和传导过程中发挥着关键作用。研究发现钠通道介导的晚钠电流(late sodium current,INa-L)也可延长QT间期,进而诱发心律失常[10,11]。伏立康唑对心脏离子通道的影响尚不明确。为探讨伏立康唑导致心脏QT间期延长及心律失常发生的离子机制,本研究利用Western blot和全细胞膜片钳技术,观察了伏立康唑对在HEK-293细胞中表达的hERG通道及Nav1.5通道表达和功能的影响,为临床工作中伏立康唑诱发的心律失常的防治提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.2 主要溶液配制

电极外液:NaCl 137 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,KCl 4 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,MgCl21 mmol/L,CaCl21.8 mmol/L;配好后,用NaOH调节pH值至7.4,0.22 μm微孔滤膜过滤后置于4 ℃冰箱保存。钠通道检测电极内液:NaCl 10 mmol/L,CsCl 130 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L;钾通道检测电极内液:KCl 130 mmol/L,MgCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,MgATP 5 mmol/L;电极内液用CsOH调节pH值至7.2,0.22 μm微孔滤膜过滤,分装于5 ml EP,-20 ℃冰箱保存。RIPA蛋白裂解液:NaCl 137 mmol/L,EDTA 2 mmol/L,Tris-HCl 20 mmol/L,Triton X-100 1%,甘油10%。TBS-T溶液:Tris-HCl 50 mmol/L,NaCl 37.5 mmol/L,吐温1‰。PBS缓冲液:NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,Na2HPO48 mmol/L,KH2PO41.5 mmol/L。

1.3 细胞株及质粒

人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney cell line,HEK293细胞)是一种常用的表达研究外源基因的细胞株,购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。SCN5A cDNA由英国曼彻斯特大学(University of Manchester, UK)张艳敏教授惠赠;hERG cDNA由美国威斯康星大学(University of Wisconsin-Madison,USA)Gail Robertson教授惠赠。

1.4 细胞培养及质粒转染

1.5 伏立康唑对hERG及Nav1.5蛋白表达的影响

选取稳定表达hERG的HEK293细胞,以适当密度接种于细胞培养皿中;培养24 h弃去原培养基,更换为伏立康唑浓度分别为0,2.5,5,10,50 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,分别干预细胞24 h,Western blot检测hERG蛋白表达。以0 μmol/L伏立康唑为对照组,比较不同浓度伏立康唑对hERG蛋白表达的影响。

选取稳定表达Nav1.5的HEK293细胞,以适当密度接种于细胞培养皿中;培养24 h弃去原培养基,更换为伏立康唑浓度分别为0,2.5,5,10,50 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,分别干预细胞24 h,Western blot检测Nav1.5蛋白表达。以0 μmol/L伏立康唑为对照组,比较不同浓度伏立康唑对Nav1.5蛋白表达的影响。

选取稳定表达Nav1.5的HEK293细胞,培养24 h弃去原培养基,更换为5 μmol/L的伏立康唑处理细胞,分别培养0,2,4,8,16,24 h,用Western blot检测Nav1.5蛋白表达。

药物干预后弃去DMEM培养液,使用预冷的PBS缓冲液冲洗培养皿2次,每35 mm小培养皿加入RIPA蛋白裂解液200 μl,收集细胞于1.5 ml EP管中后于冰上静置30 min,每10 min强烈震荡1次,12 000g,离心30 min(4 ℃),收集上清液,使用BCA法定量蛋白。每个胶孔中加入30 μg变性蛋白,SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜。PVDF膜用含有5% TBS-T的脱脂奶粉室温下封闭2 h,TBS-T溶液洗膜3次,加入5 ml按1 ∶1 000稀释的相应一抗(兔抗小鼠Nav1.5、兔抗人hERG抗体及兔抗小鼠β-actin)中,4 ℃孵育过夜,TBS-T溶液漂洗3次后,相应二抗室温孵育2 h;TBS-T溶液漂洗后用ECL试剂盒发光显像。所得蛋白表达条带用ImageJ软件进行灰度分析,以肌动蛋白(β-actin)作为内参,分析蛋白的相对表达水平。

1.6 伏立康唑对hERG通道及SCN5A通道功能的影响

分别选取对数期的稳定表达hERG的HEK293细胞和稳定表达Nav1.5的HEK293细胞接种于细胞培养皿中;培养24 h弃去原培养基,更换为伏立康唑浓度分别为0,5,10 μmol/L的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,处理细胞24 h,用全细胞膜片钳技术检测IKr、INa、INa-L电流密度及hERG通道、Nav1.5通道功能。以0 μmol/L伏立康唑为对照组,比较不同浓度伏立康唑对hERG及Nav1.5通道功能的影响。测定电流前,胰酶消化处理细胞,转移至1.5 ml EP管中待用。电极外液冲洗细胞槽后,取适量细胞滴于细胞槽中,静置10 min,使其沉降并贴壁。使用尖端直径为1～3 μm的电极,填充灌电极内液后电阻为2～5 MΩ。高阻封接形成后,轻柔给予负压吸破细胞膜,进行串联电阻和电容电流补偿,开始全细胞记录模型。分别调用不同程序记录细胞IKr、INa、INa-L电流:①hERG通道激活程序:维持电位-80 mV,给予一系列维持时间为4 500 ms的去极化刺激,刺激电压从-70 mV到70 mV,以10 mV增幅逐渐增加,此后给予维持时间为4 500 ms,电压为-50 mV的刺激诱发尾电流。②Nav1.5通道激活程序:维持电位固定在-140 mV,给予一系列维持时间为20 ms的去极化刺激,刺激电压从-80 mV起,以5 mV增幅逐渐增大到60 mV,此后电压恢复到-140 mV。③Nav1.5通道稳态失活程序:采用双脉冲刺激程序记录钠电流的失活特性。将维持电位固定在-140 mV,其指令电位依次从-140 mV至-20 mV,步长10 mV,钳制时间为500 ms。此条件脉冲钳制时间足够长,允许钠通道充分失活即达到稳态灭活。在每次条件脉冲后,都紧跟一个固定的测试脉冲,用以测定没有被灭活部分钠通道的活性,钳制时间为20 ms,指令电位为-10 mV,然后回到维持电位-140 mV,刺激间隔为5 s。④晚钠电流记录程序:维持电位固定在-140 mV,100 ms后给予维持时间为1 000 ms的去极化刺激,刺激电压为-10 mV。去极化刺激后200 ms的钠电流作为晚钠电流水平。程序记录结束后更换新的细胞。记录过程中如果电极脱落,则更换电极和细胞后重新记录。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 伏立康唑浓度改变不影响HEK-293细胞中hERG蛋白的表达水平

Western blot结果显示,与0 μmol/L伏立康唑相比,2.5,5,10,50 μmol/L的伏立康唑处理稳定表达hERG的HEK293细胞24 h,hERG蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,见图1)。

2.2 伏立康唑浓度改变不影响IKr电流密度

分别用0,5,10 μmol/L的伏立康唑干预稳定表达hERG通道的HEK-293细胞24 h,使用全细胞膜片钳技术,调用hREG通道激活程序检测IKr电流密度。以电压为横坐标,相应电流值为纵坐标,分别得出0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理24 h对hERG通道的电流-电压曲线的影响。结果显示随着伏立康唑浓度的增加,钾通道的峰值电流及尾电流的电流密度不受影响,与对照组相比,电流-电压曲线(I-V曲线)变化无统计学意义(P>0.05,见图2)。

图1 Western blot技术检测伏立康唑对HEK-293细胞hERG蛋白表达影响 (n=3)Figure 1 Effect of voriconazole on the expression of hERG detected by Western blot (n=3)

图2 全细胞膜片钳技术检测伏立康唑对HEK-293细胞IKr电流的影响 (n=10)Figure 2 Effect of voriconazole on the current of IKr detected by whole cell patch (n=10)

2.3 伏立康唑浓度及时间依赖性增加Nav1.5蛋白表达

Western blot结果显示,分别用含有0,2.5,5,10,50 μmol/L伏立康唑的高糖DMEM培养基处理稳定表达Nav1.5的HEK293细胞24 h,与0 μmol/L相比,2.5,5,10,50 μmol/L伏立康唑随浓度升高可增加Nav1.5表达(见图3A)。用含5 μmol/L伏立康唑的高糖DMEM培养基处理0,2,4,8,16,24 h检测Nav1.5蛋白,结果表明随着处理时间的延长,Nav1.5表达增加(见图3B)。

图3 Western blot技术检测伏立康唑对HEK-293细胞Nav1.5蛋白表达影响 (n=3)Figure 3 Effect of voriconazole on the expression of Nav1.5 detected by Western blot (n=3)

2.4 伏立康唑浓度依赖性增加钠电流密度

分别用0,5,10μmol/L的伏立康唑处理稳定表达Nav1.5通道的HEK-293细胞24 h,全细胞膜片钳技术调用Nav1.5通道激活程序检测峰值钠电流INa电流密度。以电压为横坐标,相应电流值为纵坐标,分别得出0,5,10 μmol/L的伏立康唑干预24 h对钠通道的电流-电压曲线的影响。结果显示随着伏立康唑浓度的增加,INa电流密度增加,与0 μmol/L相比,5 μmol/L及10 μmol/L伏立康唑干预24 h电流-电压曲线组间差异有统计学意义(P<0.05,见图4)。

2.5 伏立康唑影响钠通道激活及失活功能

通过电流-电压曲线,根据I-V曲线的线性部分获得曲线的反转电压(reversal voltage,Vreserve)。通过测量所得的电流值(I)、膜电压(Vm)水平及计算所得的Vreserve,根据公式g=I/(Vm-Vreverse)分别计算每个细胞的电导值;标准化电导值后,以标准化的电导值(g/gmax)为纵坐标,以Vm为横坐标,通过Origin 8.0软件,将所得数据用Boltzmann函数拟合,得出钠通道的稳态激活曲线(见图5A)。

结果显示伏立康唑处理24 h,钠通道的电压依赖性激活曲线稍左移(见图5A),浓度为0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理后,Nav1.5通道的半数激活电压分别为(-46.6±0.6)mV,(-50.9±1.0)mV,(-51.2±1.2)mV,5,10 μmol/L的伏立康唑处理组与0 μmol/L组比较差异有统计学意义(P<0.05),5 μmol/L及10 μmol/L组间比较差异无统计学意义(P>0.05);0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理24 h钠通道的激活斜率(k)分别为(8.2±0.3)mV,(-7.4±0.4)mV,(4.5±0.3)mV,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

分别用0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理稳定表达Nav1.5通道的HEK-293细胞24 h,全细胞膜片钳技术调用Nav1.5稳态失活程序记录钠电流的失活特性。以电压为横坐标,标准化的钠电流为纵坐标,分别得出0,5,10 μmol/L伏立康唑处理24 h的钠通道电压依赖性失活曲线。结果显示不同浓度伏立康唑不影响钠通道的电压依赖性失活特性(见图5B)。0,5,10 μmol/L伏立康唑处理24 h,钠通道的半数失活电压分别为(-64.5±0.2)mV,(-65.6±0.3)mV,(-62.3±0.3)mV,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);0,5,10 μmol/L伏立康唑处理24 h钠通道的失活斜率(k)分别为(7.8±0.2)mV,(-8.4±0.3)mV,(8.2±0.2)mV,与0 μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01图4 全细胞膜片钳技术检测伏立康唑对HEK-293细胞峰值钠电流的影响 (n=13)Figure 4 The effect of voriconazole on the current of INa detected by whole cell patch (n=13)

图5 全细胞膜片钳技术检测伏立康唑对HEK-293细胞钠通道激活及失活特性的影响 (n=13)Figure 5 Effect of voriconazole on the activation and inactivation properties detected by whole cell patch (n=13)

2.6 伏立康唑增加细胞晚钠电流水平

分别用0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理稳定表达Nav1.5通道的HEK-293细胞24 h,全细胞膜片钳技术调用晚钠电流记录程序检测INa电流水平。去极化刺激后200 ms的钠电流作为晚钠电流水平,所得电流水平用峰值钠电流标准化后比较各组间晚钠电流的差异。0,5,10 μmol/L的伏立康唑处理稳定表达Nav1.5通道的HEK-293细胞24 h,晚钠电流水平分别为(-10.8±0.3)mA,(-26.3±1.7)mA,(-68.0±7.8)mA,用峰值钠电流标准化后三组间晚钠电流水平比较差异有统计学意义(P<0.05,见图6)。

图6 全细胞膜片钳技术检测伏立康唑对HEK-293细胞晚钠电流的影响 (n=11)Figure 6 Effect of voriconazole on the late sodium current detected by whole cell patch (n=11)

3 讨论

伏立康唑是一种临床中广泛应用的三唑类抗真菌药物,近年来已有多例伏立康唑导致QT间期延长、诱发或加重心律失常的报道,但其导致心律失常的机制尚不明确[7,12-16]。快速延迟整流钾电流及晚钠电流均可以显著影响心肌细胞的动作电位,进而导致QT间期的延长或缩短,诱发室性心动过速等多种类型的心律失常[17]。随着对药物所致心律失常机制认识的不断深入,现阶段新药研发,需常规检测其对IKr的阻滞作用,以评估其导致QT间期延长和心律失常发生的可能性。伏立康唑是氟康唑的衍生物,两者具有相似的化学结构。既往研究发现,氟康唑可以浓度依赖性地抑制心脏IKr电流,导致心肌细胞QT间期延长,从而增加氟康唑诱发心律失常的风险[18,19]。Frommeyer等[20]分别用伏立康唑和氟康唑处理家兔心脏,发现两者均可导致QT间期延长及早后除极、多形性室速等心律失常;进一步降低灌流液钾离子浓度,可以增加氟康唑处理组而非伏立康唑处理组的心律失常发生率。血清钾离子浓度降低影响hERG通道的功能及细胞膜的稳定性,但不影响电压门控钠通道。研究提示伏立康唑可能不是通过影响hERG通道导致心肌细胞QT间期延长的。本实验利用稳定表达通道蛋白的HEK-293细胞,通过Western blot及全细胞膜片钳技术,发现伏立康唑对hERG通道的表达和功能均无显著影响。

近期研究显示晚钠电流的升高也可能导致QT间期延长,进而诱发心律失常[21]。晚钠电流是部分钠通道延迟失活或不完全失活而形成的持续性内向钠电流,参与维持动作电位的平台期。在生理状态下,晚钠电流强度小于峰钠电流的1%,对动作电位无明显影响。但在病理或者药物干预的条件下,晚钠电流可能出现不同程度的增强。异常增强的晚钠电流可诱发早发后除极,进而导致心律失常发生[22]。在心力衰竭、心肌梗死等病理情况下,异常增强的晚钠电流是诱发严重心律失常重要原因[23]。本研究发现伏立康唑浓度依赖性的增加Nav1.5的表达,增加峰值钠电流水平,升高晚钠电流水平。浓度依赖性地增加晚钠电流水平可能是伏立康唑导致QT间期延长的原因之一。

临床应用伏立康唑的有效血药浓度范围为1.0～5.5 mg/L[24],相当于4.29～15.73 μmol/L。5 μmol/L伏立康唑接近临床使用该药物的最低有效血药浓度。本研究发现在HEK293细胞中,5 μmol/L的伏立康唑即可时间依赖性增加Nav1.5表达并升高晚钠电流水平。临床用药过程中伏立康唑可能影响晚钠电流水平,从而增加心律失常发生的风险。在伏立康唑治疗中如合并使用其他致心律失常药物、基线QT间期延长、低钾等条件,则更容易诱发心律失常[12]。临床工作中使用伏立康唑,建议严密心电监护,纠正低钾等其他可能诱发心律失常的因素,谨防QT间期延长及心律失常的发生。

综上所述,本研究伏立康唑分别干预稳定表达hERG通道蛋白及Nav1.5通道蛋白的HEK-293细胞,结果显示伏立康唑干预可以浓度及时间依赖性增加电压门控钠通道的表达水平,增加峰值钠电流及晚钠电流水平,但不影响hERG通道的表达及快速延迟整流钾电流水平;提示晚钠电流增强可能是伏立康唑导致QT间期延长的原因之一,为临床工作中伏立康唑诱发心律失常的防治提供基础实验依据。