上杭黄崔巍山1株野生灵芝的鉴定与驯化栽培

郑新妹

(龙岩市农业科学研究所， 福建 龙岩 364000)

灵芝Ganodermalucidum隶属于真菌门Eumycota担子菌纲Basidiomycetes多孔菌目Polyporals多孔菌科Polyporaceae灵芝属Ganoderma[1]。现代药理活性研究表明，灵芝具有抗肿瘤[2]、调节免疫力[3]、镇静安神[4-5]、扶正固本[6]等疗效。近年来，随着人们养生观念的增强，灵芝的需求量不断增加。林下仿野生段木栽培灵芝的品质与野生灵芝相当，优于大棚栽培的灵芝[7]，而深受消费者喜爱。

龙岩市位于福建省西部，属亚热带海洋性季风气候，全年气候温和，雨量充沛，夏秋季温暖潮湿，森林覆盖率达79.3%，适宜发展林下灵芝仿野生段木栽培。2021年全市紫芝栽培面积为10.8 km2，成为中国最大的紫芝林下栽培基地，主栽品种为武芝2号，栽培品种较为单一，且存在菌种退化[8]等问题。本研究通过对龙岩上杭黄崔巍山1株野生灵芝子实体进行组织分离纯化菌种、形态学及ITS测序鉴定、林下栽培出芝试验和有效活性成分检测，旨在选育出适宜闽西地区气候生长的优质灵芝品种，为当地野生灵芝种质资源的驯化开发和基础研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从上杭县蛟洋镇黄崔巍山(东经116°40′9″，北纬25°15′1″，海拔900.6 m)采集到野生灵芝子实体(图1)，经组织分离获得菌株QS21-4。对照菌株武芝2号由武平县食用菌技术推广服务站提供。

图1 野生灵芝生长环境及子实体Fig.1 Growth environment and the fruiting body of wild Ganoderma lucidum

1.2 仪器与试剂

主要仪器：恒温培养摇床(QYC-2112)，上海福玛实验设备有限公司；台式离心机(TGL-16E)，济南鑫驰医疗科技有限公司；紫外可见分光光度计(UV-2802)，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

主要试剂：葡萄糖、齐墩果酸对照品购自上海生工生物工程股份有限公司；香草醛、冰醋酸、蒽酮、浓硫酸和无水乙醇等均为分析纯，购自国药化学试剂集团有限公司。

1.3 培养基

PDA培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g。土豆切丝，加蒸馏水煮沸后用纱布过滤再加入葡萄糖、琼脂定容至1 L。培养基用121℃高压灭菌15 min，用于菌种分离纯化及活化菌株。

PDB培养基：PDA培养基不加入琼脂，培养基用250 mL的三角瓶分装，用121℃高压灭菌15 min，用于收集菌丝。

原种、栽培种配方A：阔叶杂木屑78%、谷壳15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%；配方B[9]：阔叶杂木屑78%、麦麸15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%；配方C：阔叶杂木屑78%、棉籽壳15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%。干料含量40%，水含量60%，pH 6.5。原种培养料用650 mL菌种瓶装料灭菌，栽培种培养基用规格为17 cm×33 cm×0.05 cm的聚丙烯袋分装、压实，每个菌袋约重900 g，袋口清理干净后盖上菌种盖，采用121℃高压灭菌2 h。

1.4 试验方法

1.4.1菌株QS21-4子实体形态学鉴定 根据参考文献赵继鼎等[10]、陈体强等[11]、吴兴亮等[12]、林志彬[13]对取样的野生灵芝子实体形态特征进行鉴定。

1.4.2菌株QS21-4分离纯化及培养 采用组织分离法，将取回的野生灵芝子实体样品用75%酒精浸泡1 min，无菌水冲洗3遍，用无菌滤纸将野生灵芝样品表面水分吸干，将其置于无菌托盘上用无菌解剖刀将其切成长3～5 mm块状，接种到装有PDA固体培养基的培养皿上，封口，做好标记，放置于恒温培养箱内，26℃、暗培养5～7 d。培养期间注意观察菌丝生长情况，发现杂菌污染应及时处理。待菌丝长出，采用菌丝尖端分离的方法，用无菌接种针选取生长前沿的少量菌丝块置于新鲜PDA培养基上纯化培养，观察菌丝形态，获得纯培养物[14]。将得到的纯化菌株接种到试管斜面PDA培养基上，暗培养，待斜面长满后加入无菌液体石蜡，保藏于4℃冰箱中[15]。

1.4.3菌株QS21-4ITS测序与分析 选取真菌核糖体基因间隔区(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对基因组DNA进行扩增[16]，委托上海生工生物公司进行扩增和ITS双向测序。采用Lasergene中的SeqMan软件进行拼接，所得ITS序列在NCBI在线BLAST检索，与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比对分析。采用MEGA11的ClustalW做多序列联配，Neighbor Joining(邻接法)法构建系统进化树，自展值(Bootstrap)设置为1000，确定本试验分离菌株的进化分类地位[17]。

1.4.4液体发酵菌株QS21-4菌丝体有效活性成分的测定 将PDA培养基上活化好的的菌株QS21-4，用直径3 mm的打孔器延菌落边缘打取10个菌圈，接入装有100 mL的PDB培养基的三角瓶中，26℃、150 r·min-1恒温摇床暗培养5 d，匀浆30 s，取5 mL的菌液接入新的PDB培养基，26℃、150 r·min-1恒温摇床暗培养4 d，转入静置暗培养12 d[18]，过滤菌丝，55℃烘干至恒重后提取和测定其有效活性成分。菌丝体多糖和三萜的测定方法均参照参考文献滕李铭等[19]。

1.4.5菌株QS21-4原种培养基的筛选与栽培菌包的制备 培养基配方A、配方B、配方C各接种10瓶，26℃、暗培养，观察记录菌丝生长情况，筛选最适原种培养基。

将菌株QS21-4接种到筛选出的栽培种培养基上，保持温度26℃，空气湿度65%，恒温培养箱暗培养，期间查看污染情况，若有则及时清理[20]。待菌丝长满菌袋内培养基，打开菌种盖炼苗3～5 d，以满足菌丝对氧气的需求，同时让菌丝提前接触外部环境，适应外部环境，减少栽培后污染。炼苗期间注意温度控制在26℃，空气湿度85%。

1.4.6菌株QS21-4林下栽培及农艺性状测定 将栽培场地设置在上杭县蛟洋镇黄崔巍山天然次生林下，林地以栲栎树等阔叶树种为主，土质疏松，偏酸性沙质土，林分郁闭度为0.7左右。选取阴凉平坦处，挖约15 cm深的洞穴略深于菌棒，提前用生石灰对洞穴进行土壤消毒[21]，菌袋略倾斜放于洞穴，覆上厚度1～2 cm的土，盖上薄膜拱棚，自然出芝。待子实体成熟后，测量灵芝菌柄的长度、菌盖的直径、每袋灵芝鲜重，各测10袋。

1.4.7林下栽培菌株QS21-4子实体有效活性成分检测 对菌株QS21-4和对照菌株武芝2号，采收开始喷孢子粉1周内的成熟子实体，经烘干后委托广东省微生物分析检测中心对有效活性成分多糖、三萜含量检测(参照中国药典2020年版一部灵芝检测方法)。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel 2016软件和SPSS 20软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 野生菌株QS21-4子实体形态学鉴定

由图1可知，QS21-4子实体幼芝菌盖边缘黄褐色，中央紫黑色，近圆形。由图2可知，QS21-4子实体成熟后直径约38 cm，中间厚，边缘薄，菌盖和菌柄均为紫黑色，有光泽，中生，菌柄较短，菌肉黄褐色，木栓质，孢子黄褐色，形态学初步鉴定菌株QS21-4为紫芝Ganodermasinense。

图2 野生灵芝子实体Fig.2 Fruiting body of wild Ganoderma lucidum

2.2 菌株QS21-4分离纯化及培养

野生灵芝经消毒纯化后生物学菌落特征见图3。由图3A 可知，经分离获得的野生灵芝菌株QS21-4在PDA 培养基上菌落以接种点为中心呈近圆形[22]，菌丝白色，交织生长，菌落的边缘如纤毛状，菌落紧贴平板。由图3B可知，菌丝生长到后期菌落中心部位菌丝微发黄，分泌出黄褐色液体，打开培养皿盖可闻到菌香味，且在培养基表面形成一层菌皮。

图3 菌株QS21-4菌落形态Fig.3 Colony morphology of the strain QS21-4

2.3 菌株QS21-4 ITS序列系统发育分析

使用SeqMan进行拼接获得ITS序列(序列长605 bp)，与GenBank中的10个相似性高的灵芝以及灵芝属其他种ITS基因序列进行同源性比较。由图4可知，菌株QS21-4在此系统发育关系最近的为Ganodermasinense(MK345453)，即紫芝。与其野生菌株子实体形态学特征鉴定结果一致。

图4 基于ITS序列构建的NJ进化树Fig.4 NJ phylogenetic tree established based on ITS sequence

2.4 液体发酵菌株QS21-4菌丝体有效活性成分测定

由表1可知，液体发酵菌株QS21-4菌丝体多糖含量14.54 mg·g-1，三萜含量6.23 mg·g-1，均高于对照菌株武芝2号。

表1 菌丝体多糖、三萜含量比较Table 1 Comparison of the contents of polysaccharides and triterpenoids in the mycelia

2.5 菌株QS21-4最适原种培养基与栽培菌包的制备

由表2可知，菌株QS21-4菌丝在配方B培养基上萌发最快，比在配方A、C培养基上长势较好。配方B培养基的上菌丝浓密、粗壮、洁白，满瓶时间也最短，综上特征配方B培养基为菌株QS21-4最适培养基。

表2 菌株QS21-4在不同原种培养基上菌丝的生长情况Table 2 Mycelial growth of the strain QS21-4 on different pathogen culture media

将菌株QS21-4接种到配方B栽培种培养基上培养，菌丝长满菌袋后即可打开菌种盖炼苗3～5 d，菌丝微泛黄，且在袋口形成灵芝原基及芝蕾后即可栽种(图5)。

图5 灵芝栽培菌包Fig.5 Fungus pack for the cultivation of Ganoderma lucidum

2.6 林下栽培菌株QS21-4出芝管理及农艺性状的测定

菌株QS21-4林下栽培子实体见图6，菌株QS21-4子实体菌盖黑褐色，呈如意状，菌柄紫黑色，与对照菌株农艺性状见表3。由表3可知，菌株QS21-4子实体菌柄比对照武芝2号菌株短，菌盖直径和每袋灵芝鲜重则与对照菌株相当。

图6 栽培出芝试验子实体Fig.6 The tested fruiting body of Ganoderma lucidum cultivated

表3 灵芝菌株子实体农艺性状Table 3 Agronomic traits of the fruiting body of Ganoderma lucidum strains

2.7 林下栽培菌株QS21-4子实体有效活性成分含量检测

从表4可知，菌株QS21-4干燥子实体多糖含量1.66%，三萜含量1.25%，其有效活性成分多糖和三萜含量均比对照菌株武芝2号高。

表4 菌株QS21-4与武芝2号子实体有效活性成分含量Table 4 Contents of the effective active ingredients in the fruiting bodies of the strain QS21-4 and Wuzhi No.2

3 结论与讨论

紫芝Ganodermasinense是我国特有的灵芝科真菌[23]，紫芝没有赤芝的苦味，味道甘甜，适口性较好，易于服用，在国外一些对抗肿瘤和抗放射性实际应用中效果也鼓舞人心[24]，紫芝不同于赤芝的独特风味和其药用价值，使其深受广大消费者欢迎[25]。近年来，紫芝在闽西、粤东、赣南等部分县区的林下仿野生栽培规模逐渐扩大，灵芝栽培优质高产的关键是选用适宜本地优良的菌种，当地土生土长的灵芝品种具有适应性较强，有生长粗放、产量高等优点。

本研究从上杭黄崔巍山中分离1株野生灵芝菌株，通过灵芝子实体形态学特征和其 ITS序列系统发育分析，确定菌株为紫芝Ganodermasinense。通过林下栽培试验表明，在农艺性状上，菌株QS21-4子实体的菌柄比对照武芝2号菌株短，菌盖直径、每袋灵芝鲜重与对照菌株武芝2号相当；在有效活性成分含量上，液体发酵菌丝体与林下栽培子实体检测结果显示，试验菌株QS21-4的多糖和三萜含量均高于对照菌株武芝2号。灵芝作为一种药用真菌，活性成分含量是育种的关键性指标，本研究将为当地野生灵芝资源的开发选育和生产推广提供了一定参考依据。