基于网络药理学探讨葛根汤治疗急性脑梗死作用机制

黄丽贤，姜 辉，高铭媛，吴 兢，李群先，赵 博

临床将急性脑血管病按照病因分为出血性卒中和缺血性卒中，其中缺血性卒中占89.4%[1]。流行病学调查显示，全世界每年约有3300万人发生脑卒中，其中缺血性卒中约占总数的87%[2]，因缺血性卒中而死亡人数占因脑血管病死亡人数的50%以上[3]。随着人口平均年龄的增长，脑卒中发病率逐年上升，脑卒中具有发病率高、致残率高、病死率高的特点，且会增加家庭和社会负担[4-8]。

葛根汤出自《伤寒杂病论》，葛根为君药、麻黄为臣药共奏外散表寒之功，佐使药物桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣功用内调营卫，主治太阳经输不利、太阳与阳明二阳合病等症[9]。现有研究表明，中药复方，尤其是经典名方，其作用机制具有范围广、层次深、靶点多等特点。目前网络药理学是将包括中医学、生物信息学、计算机学、生物学等整合的新兴学科[10-12]，既体现中药方剂的传统特点，也提供现代研究手段对其应用进行科学深入的研究。对于揭示中药复方科学内涵、发现作用靶点、为实验验证中药复方治疗的靶点提供新方向。

1 材料与方法

1.1葛根汤相关靶点基因筛选 在中医药性味归经及功效理论指导下，以中药系统药理学数据库与分析平台[13]为依托，逐一查找葛根汤所有包含中药中所含化学有效成分，以口服生物利用度(OB)≥30%且药物相似度(DL)>0.18，对葛根汤所有药物所含化合物及药物动力学进行初步筛选，将筛选出的蛋白质靶点名称进行规范统一。为防止遗漏，同时查阅已发表的相关文献报道，补充未预测到的活性化合物已知靶点。

1.2葛根汤药物有效成分与靶点网络构建 利用Cytoscape 3.7.2[14]对所查找到的葛根汤所有药物所包含生物活性成分、各自作用靶点构建可视化网络，表示药物-有效成分-靶基因设定为“节点”，节点相互之间的关系设定为“边”。进一步网络特征分析则应用网络分析软件插件进行，结合已经发表的文献分析其相互作用，最终目的在于明确葛根汤重要的成分信息和靶点信息间的对应关系。

1.3急性脑梗死相关靶点基因筛选 以“Acute cerebral infarction”“ACI”为关键词在Genecards数据库中全面筛选急性脑梗死相关作用靶点信息，并根据搜索结果，以“分数值(Score)”大于中位数为筛选指标，获得急性脑梗死的潜在靶点。

1.4葛根汤有效成分-急性脑梗死靶点蛋白质与蛋白质间相互作用(PPI)网络构建 药物经过复杂的调控网络在人体发挥作用，药物的有效成分作用一方面体现在与靶点的直接结合，另一方面是通过间接的方式与其他靶点相结合。通过PPI数据的挖掘与构建，使靶点间存在的间接或直接调控作用关系更加清晰。为探究葛根汤组方相关靶点与急性脑梗死靶点间的相互作用，首先应用CytoScape 3.7.2中Bisogenet插件分别对两组靶点进行PPI网络构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，身份识别导出类型设定为“gene identifiers only”，其余设置均为默认设置，获取PPI网络后，以merge工具为操作手段进行融合构建。通过网络拓扑分析插件(CytoNCA)，并查询已发表相关文献作为重要补充，主要筛选指标：第一指标为紧密中心性(CC)、第二指标为介度中心性(BC)、第三指标为网络中心性(NC)、第四指标为局部边连通性(LAC)、第五指标为连接度中心性(DC)。具体筛选分为两步：第一步筛选上述五个指标中大于中位数的节点为关键靶点；第二步筛选DC大于所有节点中位数2倍的节点为重要节点。将关键靶点上传至STRING 11.0数据库构建PPI网络模型[15]，分析其参与的生物学过程，并对其功能进行描述。

1.5对相关靶点生物学功能与通路进行富集分析 将葛根汤有效成分靶点与急性脑梗死靶点取交集，并绘制韦恩图，其中共同靶点105个。应用Metascape数据库[16]进行基因注释富集分析、功能注释聚类及BioCarta&KEGG通路映射。将105个靶基因输入列表，对数据进行可视化处理。

1.6葛根汤有效成分-急性脑梗死靶点-通路网络图构建 利用CytoScape 3.7.2构建葛根汤中所有药物所含有效成分-急性脑梗死靶点信息-通路网络关系图，利用CytoNCA对有效成分、靶点的网络拓扑参数分析，具体参数包括NC、CC、DC等，综合分析核心靶点、主要活性成分。

2 结果

2.1葛根汤有效成分筛选 初步提取葛根化学成分4个、麻黄23个、白芍13个、大枣29个、甘草92个、桂枝7个、生姜6个。经ADME筛选后共获得葛根4个、麻黄22个、白芍8个、大枣18个、甘草88个、桂枝6个、生姜4个，包括福莫宁、紫杉酚、槲皮素等，见表1。葛根成分作用靶点90个、白芍成分作用靶点120个、大枣成分靶点412个、甘草成分作用靶点1837个、生姜成分作用靶点72个、麻黄成分作用靶点474个、桂枝成分作用靶点72个，合并后删除重复值共得到靶点266个。

表1 葛根汤部分有效活性成分

2.2葛根汤所有药物生物活性成分作用靶点预测及网络构建 利用CytoScape 3.7.2对葛根汤中经ADME筛选后所有生物活性成分与数据库预测的作用靶点进行关系网络绘制，同时进行全面数据分析，最终得出节点共408个，4387条边。通过网络拓扑分析确定葛根汤发挥作用的生物活性成分主要为槲皮素、地黄黄酮、山柰酚、芒柄花黄素、柚苷配基、谷甾醇、β-胡萝卜素、谷固醇等，核心靶点有F10、PTGS2、AR、ESR1、NOS2、PPARG、PTGS1、SCN5A、ADRB2、DPP4等。见图1。

图1 葛根汤生物活性成分与靶点网络图

2.3急性脑梗死相关靶点筛选 从 Genecards 数据库搜索获得急性脑梗死相关靶点共2921个。根据经验设定大于中位数10.02的目标靶点为急性脑梗死潜在靶点，最终得到相关靶点730个。

2.4葛根汤治疗急性脑梗死关键靶点筛选、PPI网络构建 应用CytoScape 3.7.2软件及Bisogenet插件,逐一对葛根汤所包含七味中药所含有效成分药物靶点进行PPI网络构建并汇总，得到6547个节点，161 771条边，对疾病靶点进行PPI网络构建，得到776个节点，14 191条边。将结果应用merge工具进行融合构建PPI网络，得到169个节点，3497条边的融合网络。利用CytoNCA分析筛选数据，并据此设定degree值大于2倍中位数为核心网络。在通过设定网络中DC、BC、CC、LAC及NC大于中位数的节点得到核心作用靶点，操作流程见图2。

图2 葛根汤治疗急性脑梗死蛋白质与蛋白质间相互作用网络构建与关键靶点筛选流程图

2.5葛根汤治疗急性脑梗死相关靶点相关通路的富集分析及生物学功能 首先将葛根汤有效成分靶点与急性脑梗死靶点取交集得到共同靶点105个。应用Metascape数据库进行基因注释富集分析、功能注释聚类及BioCarta&KEGG通路映射，结果可见多个靶点的功能与炎性介质及氧化应激有关。其中葛根汤治疗急性脑梗死参与的生物学过程主要包括前列腺素的生物合成过程、炎症反应、肿瘤坏死因子负调控、对缺氧的反应等。相关靶点调节急性脑梗死的功能主要富集于双加氧酶活性、前列腺素-内过氧化物合酶活性、血红素结合、一氧化氮(NO)合酶调节剂的活性、过氧化物酶活性等。主要相关的通路包括p53、AMPK、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、核因子-κB(NF-κB)信号通路，通路靶点结果见表2。得到的数据结果进行可视化处理，见图3、4。

表2 葛根汤治疗急性脑梗死靶点通路富集结果

图3 葛根汤治疗急性脑梗死靶点的GO功能富集分析

图4 葛根汤治疗急性脑梗死靶点的KEEG通路分析

2.6葛根汤有效成分-急性脑梗死靶点-通路网络图构建 再次利用CytoScape 3.7.2软件构建葛根汤有效成分-急性脑梗死靶点-通路网络，见图5。具体分析参数为网络拓扑学，利用插件为Network Analyzer，最终得到核心作用靶点、核心成分。见表3。PTGS2在整个网络中连接度为超过100，具体数值为112，介度值为0.228 451 227，紧密度值为0.623 342 175，预测PTGS2为葛根汤所有药物有效成分中治疗急性脑梗死最主要靶点，ESR1、AR、NOS2、PPARG、PTGS1、F10、SCN5A、DPP4ADRB2等亦为相对重要的靶点，见表4。

图5 葛根汤成分-急性脑梗死靶点-通路网络图

表3 葛根汤主要活性成分网络节点特征参数

表4 葛根汤主要活性成分靶点网络节点特征参数

3 讨论

急性脑梗死属于中医“中风”范畴，涉及的主要脏腑器官有脑、心、肝、肾、筋、脉，其病因病机为“邪实、正虚、虚实兼杂”。正虚者为阴阳气血亏虚；邪实者为六淫、七情、内生五邪。脑为髓海，头为清窍，必依赖清阳濡养，头脑方可精明。中风病最终邪犯头脑。若因邪阻，清阳不能上达、阴精不能上奉；或清阳馁弱无力上奉、阴精虚衰无力上充。皆令头脑失灵而容易犯病导致中风、头痛、眩晕、面瘫等。

中风病其病因病机素来有“外风”“内风”学说之争，《内经》所记述的“大厥”“薄厥”“仆击”“偏枯”“风痱”等病证，与之症状相似。《素问·风论》主要论述外风。《灵枢·刺节真邪》论述外风联合内虚夹杂而病。《金匮要略》正式提出中风病，其中寓外风内风合而为病之意，遂有侯氏黑散之堵截祛风，防己地黄汤滋阴息风，风引汤用诸石药鳞介药，镇降息风。

本文基于前期临床研究发现应用葛根汤治疗缺血性中风病疗效可，细究其理论来源，可从外风论治中风病，方中葛根上入脑窍督脉巅顶，麻黄、桂枝、葛根祛风宣阳通痹，方中有桂枝汤寓意调和阴阳、调和营卫兼有补益，契合中风病外风兼有内虚之理，全方共奏辛温通阳、宣阳通痹、祛风扶正之功。

葛根汤见于《伤寒论》，君药葛根重在治疗项背不舒、臣药麻黄解肌发表、佐使药物包括桂枝汤，具有发汗解表、生津液、濡养经脉的作用[9]。葛根汤具有很强的抗炎镇痛作用[17]，周军等[15]研究发现，葛根汤能对抗关节炎，其作用机制与下调足关节组织中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；使用不同溶剂提取葛根汤溶液在抗炎镇痛方面差异明显，乙醚和正丁醇提取的葛根汤溶液治疗效果最优；刘梅等[16]研究葛根汤能上调BCL2蛋白表达同时下调颈椎间盘中Fas表达，有延缓椎间盘蜕变的作用；葛根汤可缓解大鼠退变颈椎间盘模型的氧化应激，PI3K/AKT信号通路可以通过调节Nrf2信号通路调控机体的氧化应激水平，抑制PGE2的表达量及环氧化酶(COX)活性[18-20]。

本研究以网络药理学方法为研究手段，最终揭示葛根汤治疗急性脑梗死的最主要药物活性成分为槲皮素。槲皮素具有清除自由基、抗氧化、抗血小板聚集、神经保护等药理作用[21-23]。槲皮素能够通过同时抑制氧化应激与炎症反应，最终达到对神经元细胞的保护作用[24]。动物实验证明槲皮素能够改善急性脑梗死大鼠受损神经功能[25]，具体作用机制可能通过抑制细胞凋亡和氧化应激水平，通过抑制IL1、IL6、TNF-α的表达释放，抑制神经元凋亡，最终起到保护神经的作用，同时显著抑制脑出血后小胶质细胞的活化，减少脑出血后神经元的损伤[26]。

本研究结果表明，葛根汤治疗急性脑梗死的靶点主要集中在PTGS2，而核心靶点有ESR1、AR、NOS2、PPARG、PTGS1、F10、SCN5A、DPP4、ADRB2等。人PTGS2基因定位于1q25.2～25.3，包含9个内含子与10个外显子，约为8.3 kB，且外显子10显著大于其余外显子，包含410碱基对编码区和全长为2550碱基对的3'非翻译区。PGE2的形成高度依赖于这些细胞中前列腺素内PTGS2的表达。TNF-α通过TNF通路能够诱导的PTGS2的产生，其作用机制为TNF-α增加了PTGS2基因的转录。另一方面，IL-4抑制PTGS2 mRNA和蛋白的表达以及类前列腺素的产生[27]。通过对药物和疾病融合后的关键网络进行GO功能富集分析显示，葛根汤能够通过调控mRNA代谢过程、调控基因表达、核酸代谢过程、含核碱基的化合物代谢过程对急性脑梗死发挥作用。在对相关通路富集分析研究中发现葛根汤治疗急性脑梗死重要的信号通路包括HIF-1、P53、NF-κB等。

HIF隶属于bHLH-PAS转录因子超家族，由组成型表达的HIF-β亚基(HIF-1β)和对缺氧敏感的HIF-α亚基组成异构二聚体发挥其生物学功能[28]，其中后者包括3个亚型:HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，目前研究最深入且功能最突出的是HIF-1α[29]。HIFs活性的调节主要依靠调节HIF-α亚基的蛋白稳定性来实现，α亚基的蛋白稳定性被氧气依赖的羟基化严格调控。常规有氧条件下，HIF-1α不稳定，原因是其被不断地降解而处于低水平状态。脯氨酰羟化酶(PHD)使得HIF-1α亚基402位及564位脯氨酸羟基化，羟基化后通过泛素-蛋白酶体途径被迅速降解，关键物质为包含肿瘤抑制蛋白von Hippel-Lindau(pVHL)的E3泛素连接酶复合物。除此之外，常规有氧环境下，FIH-1促使HIF-1α 804位天冬酰胺发生羟基化，结果是抑制其与P300的结合，最终抑制HIF-1α转录激活功能的实现。而缺氧条件下则恰恰相反，PHD与FIH-1的羟基化酶活性均受到抑制，HIF-1α转位入核与HIF-1β结合形成转录复合物与其靶基因启动子区域的低氧反应元件结合，启动下游众多基因的转录表达而参与脑血管病病理过程。

研究结果表明葛根汤中所包含有效成分较多，可调控靶点众多，同一靶点又可介导不同的生物学过程并涉及众多信号通路，是葛根汤治疗急性脑梗死多靶点、多途径的理论基础。在应用网络药理学分析过程中，我们初步探究了葛根汤治疗急性脑梗死的调节网络，为临床应用提供了一定依据。在本研究的基础之上，后期应通过实验进一步验证相关指标和靶点，为疗效评价提供客观依据。