血清miR-208在慢性心力衰竭中的表达及临床意义

李岗峰，刘璐，李刘文

榆林市第二医院急诊科，陕西 榆林 719000

心力衰竭(heart failure，HF)是因心肌病、心肌梗死等原因所致的心肌损伤而引起的心肌结构及功能改变，最终引起心室泵血或充盈功能低下表现的疾病[1-2]。慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)指持续存在心力衰竭状态，可稳定、恶化或代偿[3]。尽管近年来在控制心血管疾病方面取得了很多进展，但CHF的发病率仍在增加，因此需要新的诊断和治疗方法[4-5]。内源性小非编码RNA(microRNA，miRNA)可以通过加速mRNA 激活来刺激基因表达，或通过与mRNA的3'-非翻译区域的不完全序列特异性相互作用来阻止其翻译。其中miR-208 由α-肌球蛋白重链(alpha-myosin heavy chain，α-MHC)内含子编码，并在心脏中特异性表达，证据表明miR-208 可调节心脏发育，并且参与维持对传导系统发育重要的心脏转录因子的表达，miR-208的表达还与心肌细胞的增殖和分化有关，并且对心肌细胞凋亡具有重要的调控作用[6-7]。但目前关于miR-208在CHF患者中表达情况方面的研究较少。本研究旨在探讨血清miR-208水平在CHF患者中的表达及其临床意义，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年6 月至2021 年1 月期间榆林市第二医院急诊科收治150例的CHF患者纳入研究。纳入标准：①均符合慢性心力衰竭诊断治疗指南[8]；②心力衰竭的症状至少持续6 个月；③患者神志清醒，可配合进行相关检查。排除标准：①就诊前6 个月内患者发生脑血管意外；②急性感染，慢性炎症；③严重心律失常；④急性心肌梗死；⑤恶性肿瘤；⑥肝肾功能衰竭；⑦精神障碍或妊娠者。150患者中男性77 例，女性73例；根据美国纽约心脏病协会心功能(NYHA)分级，将患者分为A组(NYHAⅠ～Ⅱ级)46例，B 组(NYHAⅢ级)55 例和C 组(NYHAⅣ级)49 例。选择我院同期体检的无CHF 患者46 例作为对照组。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 血清样本收集 四组受检者均空腹采集肘静脉血标本，置含抗凝剂试管中以3 000 r/min 离心10 min，将血清转移至无核酸酶的Eppendorf 管中并储存于-80℃备检。

1.3 资料收集 收集所有受检者的基础临床资料，包括：(1)临床资料：病史、吸烟史、血压、身高、体质量、体质量指数；(2)实验室检查指标：常规血液数据、肝肾功能、血糖水平、血脂水平、血清N 端前脑钠素(NT-proBNP)水平等血液生化指标；(3)影像学指标：左心室射血分数等超声心动图结果，以及左心房(LA)直径和心胸比率等X射线检查结果。

1.4 RNA 提取和实时定量PCR (1)总RNA 的提取：使用TRIzol 试剂提取总RNA，以75%乙醇代替异丙醇进行RNA 沉淀。使用NanoDrop 1000 分光光度计测定RNA 质量。(2) qRT-PCR：以DBI Bestar qPCR RT 试剂盒(DBI Bioscience，Ludwigshafen，德国)将1 μ g RNA 反转录成cDNA。使用7500 Fast Real-Time PCR，qRT-PCR 条件：在95℃温育2 min 后进行40 个循环：95℃退火15 s，60℃60 s。miR-208 PCR 引物由瑞博生物科技有限公司设计，序列如下：miR-208，F：5'-GTCATCTAGAAAGCTTGATGCAGG AAAGAGCTTTGG-3，R：5'-TGACAGATCTCAGCTG A-CATCCTCTAGGCTGGGGTT-3'；内参：U6，F：5'-CT C-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'，R：5'-ACGCTTC A-CGAATTTGCGTGTC-3'。使用2-△△Ct公式对miRNA进行定量。重复3次，取平均值。

1.5 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件分析数据。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用Lsd-t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson检验分析不同指标间的相关性。均以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组受检者的一般资料比较 四组受检者的年龄，性别，血压，高血压病史或糖尿病病史、BMI及血清空腹血糖、总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，肌酐(creatinine，Cr)水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 四组受检者一般资料比较[±s，例（%）]

表1 四组受检者一般资料比较[±s，例（%）]

注：1 mmHg=0.133 kPa。

因素年龄男/女高血压史糖尿病史吸烟者收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)BMI(kg/m2)空腹血糖(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)Cr(μmol/L)A组(n=46)65.53±11.74 24(52.17)/22(47.83)18(39.13)10(21.73)12(26.08)125.72±31.93 79.12±22.51 20.45±5.89 5.69±0.83 4.18±1.21 1.28±0.32 86.53±16.52 B组(n=55)64.83±16.21 26(47.27)/29(52.73)30(54.54)12(21.81)14(25.45)129.14±26.41 76.61±17.33 21.37±4.37 5.90±1.32 4.23±1.61 1.33±0.13 91.14±14.36 C组(n=49)63.24±12.38 27(55.10)/22(44.90)28(57.14)14(28.57)14(28.57)127.61±23.62 74.94±12.63 22.88±5.54 5.81±1.68 4.12±0.95 1.39±0.12 88.67±15.29对照组(n=46)59.11±13.76 23(50.00)/23(50.00)21(45.65)10(21.73)9(19.56)121.15±14.21 76.95±10.53 21.99±6.67 6.00±0.99 4.16±0.78 1.29±0.27 95.02±16.12 χ2/F值2.056 0.679 3.956 0.947 1.093 2.000 0.520 1.581 0.510 0.075 2.411 2.551 P值0.108 0.878 0.266 0.814 0.779 0.115 0.670 0.195 0.676 0.973 0.068 0.057

2.2 四组受检者的血清miR-208 表达水平比较 A 组、B 组和C 组患者的miR-208 相对表达水平分别为1.43±0.30、1.84±0.51、2.11±0.69，均较对照组的0.99±0.14更高，且miR-208表达水平随心功能NYHA分级升高而升高，差异具有统计学意义(F=52.100，P＜0.05)。

2.3 四组受检者的心脏功能指标比较 四组受检者的NT-proBNP，LVEF，LA直径和心胸比率比较差异均具有统计学意义(P＜0.05)，其中三组患者的NT-proBNP 水平较对照组升高，LVEF 水平降低，LA直径升高以及心胸比率增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。此 外，患 者NT-proBNP 水 平 随 心 功 能NYHA 分级升高而升高，LVEF 随心功能NYHA 分级升高而降低，LA 直径随心功能NYHA 分级升高而升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 四组受检者的心脏功能指标比较（±s）

表2 四组受检者的心脏功能指标比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与A组比较，bP＜0.05；与B组比较，cP＜0.05。

组别A组B组C组对照组F值P值例数46 55 49 46 NT-proBNP(pg/mL)432.95±103.88a 519.72±142.73ab 681.99±206.17ac 309.82±95.16 55.353 0.001 LVEF(%)49.21±6.01a 38.56±5.31ab 29.64±2.43ac 58.64±9.45 195.853 0.001 LA直径(mm)43.31±7.62a 49.69±8.83ab 53.94±4.32ac 37.29±5.97 52.429 0.001心胸比率0.61±0.07a 0.63±0.08a 0.67±0.07a 0.50±0.01 59.544 0.001

2.4 血清miR-208 水平与患者临床病理参数的相关性 经Pearson 相关性分析结果显示，血清miR-208相对表达水平与患者NT-proBNP，LA直径正相关(r=0.784，0.524，P＜0.05)，与LVEF 负相关(r=-0.375，P＜0.05)，见表3。

表3 血清miR-208与患者临床病理参数的相关性

3 讨论

心肌重构是CHF 发生时机体对于损伤的一种适应性反应，研究表明miRNA在心肌重构过程中发挥着关键作用[9-10]，比如miR-21 可以通过靶向抑制p27 来影响心肌细胞自噬，而心脏的稳态和功能需要适当的自噬水平进行维持，自噬被抑制可能是心肌重构的一个重要原因[11]。另有报道，外源性miR-208 可以诱导心脏重塑，并可通过调节肥大通路成分的表达，上调β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)而在压力依赖性心肌生长过程中具重要作用[12]。虽然已有多项研究证实miRNA 与HF 的进展和预后密切相关，但其潜在机制尚未完全明确[13]。因此本研究旨通 过分析CHF患者的血清miR-208表达水平，以研究血清miR-208 作为CHF 患者血清生物标志物的潜力。本研究发现HF 患者的血清miR-208 水平高于对照组，且心功能分级越高，血清miR-208 水平越高，这些结果表明血清miR-208 水平与CHF 的发病和严重程度有关。研究发现miR-208 在心脏发育和心脏病理学过程中差异表达，与其宿主基因α-肌球蛋白(α-MHC)和β-肌球蛋白(β-MHC)表达平行[14]，该研究结果表明miR-208 在心脏中过度表达可诱导心肌肥大，这一过程可能与miR-208对靶向甲状腺激素相关蛋白1和肌肉生长抑制素有关，上述因子均是肌肉生长和肥大的重要负调节因子；另外miR-208对于正常心脏传导也有重要作用，心脏传导功能获得和丧失与心律失常有关。因此，血清中异常的miR-208 表达水平可能意味着甲状腺激素相关蛋白1 和肌肉生长抑制素的失调控，进而导致心力衰竭严重程度增加。

本研究还发现，CHF组患者的NT-proBNP水平较高，LVEF较低，LA直径较大，心胸比率更高。提示心功能指标：包括NT-proBNP 水平，LVEF，LA 直径和心胸比率与CHF 的发展和进展密切相关。过去的报道显示NT-proBNP表达可以作为CHF的一个风险参数，NT-proBNP 的表达与CHF、中风和死亡风险增加呈正相关[15]。这与本研究中CHF 患者NT-proBNP 水平明显高于对照组的结果相一致。为了更好地了解血清miR-208 水平与心脏功能指数之间的相关性，本研究进行了Pearson相关分析以探讨各指标相关性，结果显示miR-208 血清水平与LVEF 呈负相关，而与NT-proBNP，LA 直径和心胸比呈正相关，关于miR-208对上述指标的影响机制尚未明确。过去的研究结果显示：miR-208可能参与调节心肌肥厚，心肌纤维化和心肌离子通道变化的病理过程[16]。这可能是血清miR-208水平升高对上述心脏功能指标影响的基础。

总之，本研究表明，CHF 患者的血清miR-208 表达水平升高，随患者NYHA分级升高而愈加明显。此外，血清miR-208水平与心脏功能指数(包括NT-proBNP 水 平，LVEF，LA 直 径 和 心 胸 比)密 切 相 关。miR-208 血清水平可作为评估CHF 严重程度的潜在生物标志物。为了证实这些结果，还需要对更多的来自其他人群的患者进行相关研究。