基于网络药理学的四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制分析

张毅 黄雯 卢僖

摘要：目的：运用网络药理学的方法探索四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制。方法：通过TCMSP数据平台，获取四君子汤的活性成分及作用靶点;利用GeneCards和Disgent数据筛选出心肌肥厚疾病相关靶点，将两者取交集，导入Cytoscape3.8.0软件构建药物-疾病-靶点相互作用网络;利用String11.5获得PPI蛋白互作关系网络;使用R语言进行GO、KEGG基因富集分析，获得四君子汤干预心肌肥厚的潜在信号通路。结果：筛选出四君子汤有效活性成分136个，作用靶点254个;心肌肥厚疾病相关靶点4015个;四君子汤与心肌肥厚共同作用靶点160个;PPI关系网络分析后得到TNF，IL-1β和IL-6等关键靶点;GO基因富集分析主要富集在药物反应，细胞因子等相关的生物过程;KEGG通路分析主要集中在PI3K-AKT，TNF，MAPK以及HIF-1信号通路上。结论：四君子汤可能通过靶向TNF，IL-1β和IL-6等核心靶点达到干预心肌肥厚的作用，其机制与调控炎症信号途径，抑制炎症反应激活有关。

关键词：网络药理学;四君子汤;心肌肥厚

【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2022）08--02

心肌肥厚（hypertrophiccardiomyopathy）是心肌组织超负荷的一种代偿性反应，主要特征为心肌细胞体积增大，蛋白合成增加以及间质成分改变，是引起多种心血管疾病如心率失常，心衰和心源性猝死发病率和病死率升高的独立危险因素之一[1]。

四君子汤来源于宋《太平惠民和剂局方》，为益气，健脾，化痰的代表方剂，由人参、白术、茯苓、甘草组成，具有补气，益气健脾之功效。研究表明，四君子汤可以改善慢性左心衰模型大鼠的心功能，缓解心力衰竭患者的临床症状，提高心功能、延缓心室重构，改善生活质量及预后[2]，但其治疗心肌肥厚的有效活性成分及作用机制仍不清楚。

网络药理学是以网络信息为平台，分析药物-疾病-靶点之间“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系的新兴学科。其整体性和系统性以及注重药物与靶点以及疾病相互作用的特点与中医药学的研究理念不谋而合。为了明确四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制，本文基于网络药理学研究方法对四君子汤治疗心肌肥厚的生物学物质基础及药效机制进行预测，并通过分子对接对药物的主要的活性成分和潜在靶点间的相互作用进行验证，初步阐明四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制。

1.材料与方法

1.1四君子汤活性成分收集与筛选

四君子汤包含人参、白术、茯苓、甘草四味中药，将这四味中药分别以中文名称作为关键词，输入中药系统药理学数据库平台TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）进行检索以其参数中的口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为限制条件进行筛选，筛选后获得有效化学成分作为四君子汤的活性成分。再根据相应的活性成分寻找与之对应的靶点。

1.2四君子汤中活性成分潜在靶点与心肌肥厚的疾病靶点预测

基于TCMSP数据库平台得到的四君子汤的成分靶点，利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将相应的蛋白质名称转化为Genesymbol。利用GeneCardsandDisgent数据库（http：//www.genecards.org/和https：//www.disgenet.org/），以“hypertrophiccardiomyopathy”为关键词搜索，得到心肌肥厚相关的靶点，在删除其重复的靶点后，利用韦恩图将药物靶点与疾病靶点进行求交集作為“Hub”靶点，即四君子汤治疗心肌肥厚的潜在作用靶点。

1.3“药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析

为了明确药物是通过哪些成分及靶点作用于心肌肥厚的，我们利用Cytoscape3.8.0软件进行“药物-成分-靶点-疾病”网络可视化的构建。

1.4靶蛋白相互作用网络图（PPI）构建

将四君子汤治疗心肌肥厚的潜在作用靶点导入STRING11.5数据库（http：//string-db.org），并将其物种限定为“homosapiens”，设置置信度≥0.4，同时去除孤立的靶点蛋白，得到蛋白与蛋白相互作用网络。将该数据导入Cytoscape3.7.2软件进行拓扑学分析，通过NetworkAnalyzer工具进行网络分析从而获得Degree值，从而确定该网络中的核心基因。

1.5GO功能及KEGG通路富集分析

将四君子汤对心肌肥厚的潜在作用靶标基因利用R语言Clusterprofiler程序进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，设定P≤0.05得到相应的生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）以及KEGG信号通路。利用R语言pathview功能将GO富集的前12条条目及前20条信号通路制成气泡图。

2.结果

2.1四君子汤候选活性成分及候选靶标蛋白筛选

将人参、白术、茯苓和甘草作为关键词分别输入TCMSP数据库进行检索后，根据OB≥30%和DL≥0.18的候选化合物共得到136个成分，其中人参22个、白术7个、茯苓15个、甘草92个。然后将对应的化合物分子查询相关蛋白，将所有蛋白全称经Uniprot数据库标准化。在删除重复靶点后，共计获得254个靶点蛋白。这表明四君子汤是通过多靶点的协同作用发挥功能的。

2.2四君子汤活性成分治疗心肌肥厚的潜在靶点蛋白信息

在GeneCard和Disgenet数据库检索关键词“hypertrophiccardiomyopathy”，结果得到相关基因共4015个。将4015个疾病相关基因和254个药物潜在靶点进行映射，获取两者之间的交集基因160个（图1 A），进一步通过Cytoscape3.8.0软件构建四君子汤-靶点-心肌肥厚关系图（图1B），提示四君子汤对心肌肥厚的治疗作用可能与这160个交集靶点有关。

2.3蛋白质相互作用关系分析（PPI）

我们进一步将得到的160个共同作用靶点上传至String11.5数据库中，得到蛋白质互作网络信息，通过将PPI网络导入Cytoscape3.7.2软件中进行网络分析，再按“degree”值进行排序，得到蛋白质相互作用关系网络图（图2A）。该网络由160个节点，3318条边组成，其中degree值前10的蛋白靶点包括VEGFA，CASP3，HIF1A，AKT1，EGFR，TP53，JUN，TNF，IL-1β和IL-6（图2B），提示它们可能是四君子汤作用于心肌肥厚的核心靶点。

2.4靶蛋白的富集分析

2.4.1GO富集分析

为了进一步明确160个靶点蛋白的生物学功能，将药物-疾病的共同靶点输入R语言Clusterprofiler程序中，分别进行分子功能（GOmolecularfunctions）、生物途径功能（GObiologicalprocesses）和细胞成分（GOcellularcomponents）三个方面的GO富集分析，根据Count值由大到小，同时满足p<0.05进行排序，分别在BP、MF和CC中选出排名前12的条目制作条形图。结果显示四君子汤与心肌肥厚交集基因在生物过程BP显著富集在RNA转录，药物反应，细胞凋亡和增殖等（图3）。分子功能MF主要富集在蛋白结合，酶结合，细胞因子活性等。细胞组成CC主要富集在细胞外液，质膜，细胞液等中。

将药物-疾病共同作用的160个靶点输入R语言Clusterprofiler程序中KEGG通路富集分析得到163条通路，选取P值小和Count值较大的前20的通路，按GeneRatio大小顺序排列进行可视化。由KEGG富集分析结果可知，四君子汤治疗心肌肥厚的作用途径与信号通路是复杂多样的，最有可能与细胞增殖PI3K-AKT，炎症相关的TNF，代谢相关的MAPK以及低氧应激HIF-1信号通路相关（图4）。

四君子汤是益气健脾的基础方，其组方中包含人参，茯苓，白术，炙甘草四味中药。方中人参甘温扶脾养胃，大补元气为君药，白术苦温，燥湿健脾为臣药，茯苓甘淡，健脾祛湿为佐药，甘草甘温，益气和中，调和诸药，为佐使之药[3]。研究筛选出四君子汤有效活性成分136个，可作用于心肌肥厚的作用靶点160个，这与中药复方制剂多成分、多靶点干预疾病的特性相吻合。心肌肥厚的发生与机械性、神经体液、内分泌、交感神经系统活性、细胞因子、一氧化氮以及肠道菌群稳态等多种因素相关提示调节内分泌或者是肠道稳态能是干预心肌肥厚的重要方向之一[4]。有研究发现，四君子汤能够通过调节肠道菌群失衡改善心肌线粒体功能等方面，对心肌肥厚发挥一定的治疗作用[5]。由此可见，四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制可能与调节肠道微生态和提高线粒体活性有关。

本研究对四君子汤治疗心肌肥厚的有效成分进行筛选，发现排名靠前的是山奈酚、木犀草素和槲皮素等核心化合物，提示这可能是四君子汤干预心肌肥厚的有效核心成分，而这些药物都与抗炎和抗氧化有关[6]。进一步的研究发现，在君子汤干预心肌肥厚的靶点蛋白互作网络中发现炎症细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和低氧应激HIF-1参与其中，KEGG通路富集分析结果同样也提示四君子湯治疗心肌肥厚的信号途径与TNF和HIF-1通路有关。GO功能富集分析结果表明共同作用靶点的生物过程主要涉及到细胞因子等。由此可见，四君子汤治疗的心肌肥厚的分子靶点与作用机制可能与调控炎症信号途径，抑制炎症反应激活有关。

综上所述，本研究通过网络药理学初步分析了四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制。结果发现四君子汤可能通过IL6、IL-1β和HIF-1等靶点起作用，通过对细胞增殖凋亡和细胞因子代谢的反应等生物过程调控，以及炎症相关的TNF和低氧应激HIF-1等信号通路发挥干预心肌肥厚的作用。上述结果为探索四君子汤治疗心肌肥厚的作用机制研究提供理论支撑与科学依据。

参考文献：

[1]Heineke，J.andJ.D.Molkentin，Regulationofcardiachypertrophybyintracellularsignallingpathways[J].NatRevMolCellBiol，2006.7（8）：589-600.

[2]邱俊，刘友章，王超等.从四君子汤对慢性心衰大鼠心功能的影响探讨“心脾相关[J].时珍国医国药，2013.24（10）：2564-2566.

[3]刘琳，李岩.四君子汤对胃肠道药理作用的研究进展[J].医学综述，2019.25：990-994.

[4]Nakamura，M.andJ.Sadoshima，Mechanismsofphysiologicalandpathologicalcardiachypertrophy[J].NatRevCardiol，2018.15（7）：387-407.

[5]卢永康，陈窕圆，庄贤勉等.四君子汤调节大鼠肠道菌群改善心肌肥厚诱导心力衰竭的研究[J].现代中药研究与实践，2020.34（5）：29-33.

[6]He，Y.Q.，etal.，Naturalproductderivedphytochemicalsinmanagingacutelunginjurybymultiplemechanisms[J].PharmacolRes，2021.163：105224.