宁夏鸡传染性支气管炎病原学检测及N 基因序列分析

闵 泽，周海宁，马 龙，尹 才，马 林，魏凡华，李知新

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性的传染病。IB 在世界广泛流行，是导致养禽业经济损失的重要病因之一[1]。IBV 最初只导致感染鸡群出现呼吸道症状，随着病情发展，将侵害蛋鸡的生殖系统，致使蛋质量下降。其中，肾型IB 主要侵害雏鸡的肾脏，引起肾脏病变，导致雏鸡死亡[2]。我国从1977 年开始对该病进行研究，各地区相继分离出了IBV 毒株。IBV 流行毒株基因型复杂[3]，主要为QX、4/91、TW、Mass 型，其中QX型是优势基因型[4]。

IBV 基因组全长约27.6 kb，核酸为单股正链RNA，编码4 种结构蛋白，分别为核蛋白（N）、纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）及小膜蛋白（E）。N 蛋白上存在抗原决定簇，具有免疫识别位点，是IBV 重要的免疫原，对机体产生体液免疫发挥着关键作用[5]。同时N 蛋白编码基因是IBV 基因组中的保守结构域，不易发生突变，在病毒复制、转录时处于关键位置[6]，但其突变会改变保护性。因此，分析分离株的N 蛋白编码基因，有助于了解病毒在当地的流行趋势和遗传演化规律。

近年来，宁夏报告了多起IB 疫情，严重影响了当地养禽业发展。为摸清IB 流行状况和IBV 优势基因型，采集鸡咽喉/泄殖腔拭子开展了研究，以期为宁夏IB 疫情防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2021 年9—11 月，在宁夏利通区、中宁县、沙坡头区、惠农区、大武口区、隆德县、原州区、西吉县等8 个县（区）的8 个规模化养殖场和3 个散养户，按不同饲养场舍划分采样群体，每个场舍采集日龄相同的蛋鸡咽喉/泄殖腔拭子共646 份，-80 ℃保存。

1.1.2 主要仪器 核酸提取仪，B24NP968-S 型，西安天隆公司产品；紫外凝胶成像仪，univeral hood II，美国伯乐公司产品；基因扩增仪，PCT200 型，美国伯乐公司产品；电泳仪，DYY-2C 型，电泳槽，DYYCP-31C 型，均为北京六一生物科技有限公司产品；高速冷冻离心机，5424型，德国艾本德公司产品。

1.1.3 主要试剂 磁珠法病毒RNA 提取试剂盒，购自西安天隆公司；DL 2 000 DNA Maker和PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus），均购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）；SPF 鸡胚，购自山东浩泰畜禽养殖基地。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离培养 将样品置于预先加入含有青霉素（10 000 U/mL）及链霉素（10 000 μg/mL）的1 mL PBS 缓冲液的离心管中，振荡2 min，8 000 r/min 离心2 min，取上清液收集到离心管中；将已孵育9～10 d 的SPF 鸡胚，用碘伏和酒精依次消毒后，钻孔接种病毒，72 h 后收集全部尿囊液，用含有10 000 U/mL 的青霉素和10 000 μg/mL 链霉素的PBS 缓冲液稀释5～10 倍，按此方法盲传3～5 代。

1.2.2 引物合成 根据文献[7]设计合成一对引物，预期片段大小为409 bp。引物序列见表1。

表1 参考引物序列

1.2.3 RT-PCR 检测 选择盲传至第4 代的明显出现矮小化等典型IB 症状的鸡胚，收集尿囊液，按照GB/T 23197—2008 中的方法，将尿囊液稀释后作为待检材料。使用磁珠法病毒RNA 提取试剂盒进行核酸提取。反应体系：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1.0 μL、2×One Step Buffer（Dye Plus）12.5 μL、模板 1.0 μL、Forward primer 1.0 μL、Reverse primer 1.0 μL、RNaseFree H2O 8.5 μL，反应总体积25.0 μL。扩增产物用1%凝胶电泳进行鉴定。将电泳条带约为409 bp 大小的扩增产物送至华大基因公司进行测序。

RT-PCR 扩增参考程序：50 ℃ 30 min，94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，50.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物4 ℃待检。

1.3 分离毒株序列分析

分离株N基因测序后，与NCBI 数据库中29株我国和其他国家早期分离的IBV 毒株N基因序列进行比对，利用MEGA7.0 软件绘制系统发育进化树。主要参考毒株见表2。

表2 参考毒株序列

2 结果

2.1 RT-PCR 检测

646 份鸡咽喉/泄殖腔拭子，经RT-PCR 扩增和电泳，发现88 份样品呈现单一清晰条带，大小约409 bp，与预期条带相符，确定为IBV 阳性，总阳性率为13.62%。部分样品检测结果见图1。

不同地区和养殖类型统计结果（表3）显示：西吉县阳性率最高，为36.00%，其次是利通区，阳性率为32.29%，其他县区阳性率较低；规模化养殖场阳性率普遍高于散养户。

表3 宁夏8 个县（区）鸡咽喉/泄殖腔拭子样品检测结果

2.2 N 基因遗传进化分析

本试验成功分离到1 株IBV 毒株（NXIBV）。遗传进化分析结果（图2）显示，除Ark99 株较为独立外，分离株与其他参考毒株形成了3组进化群，处于第Ⅲ进化群（QX 型），与我国山东SDIB702/2012 株、SDIB778/2012 株及SDIB662/2011 株的亲缘关系最近，同源性分别为97.55%、97.29%、97.28%，与韩国K047-12 株同源性为97.01%；与我国优势毒株QX 型代表株（KM586818）同源性较高，为93.31%，与TW、4/91、TC07-2 等的同源性为85.60%～89.67%；与我国常用的疫苗血清型H120（AY028296）、M41（DQ834384）毒株同源性分别为86.67%和86.14%。

3 讨论

IB 严重威胁着我国养鸡业。临床中，肾型IB最为常见[8]，导致的雏鸡死亡率可达30%以上，剖检可见肾脏出现大量尿酸盐沉积，伴随出血，呈花斑状[9]。本试验对部分症状明显的病死鸡进行病理解剖，发现与肾型IB 病变较为一致。本次试验发现，70 日龄左右的蛋鸡阳性率最高，说明IBV更易感染较小日龄蛋鸡。

董志华等[10]报道，2009—2017 年广西IB 平均阳性率为11.5%；丘旭龙等[11]报道，河南省2010—2011 年IB 最高阳性率为15%。江苏、山东、四川等省份在2008—2020 年进行过IB 流行病学调查，发现该病一年四季均可发生，但在秋季和冬季检出率较高，发病率为11%～15%[10-16]。本试验发现，宁夏地区蛋鸡群的IBV 总体阳性率为13.62%，与国内其他省份近十年状况基本相同。

基因分析结果表明，本试验分离株与29 株参考毒株的N基因序列形成了3 个较大的分支，而分离毒株处于第Ⅲ分支（QX 型），与SDIB702/2012株亲缘关系最近，同源性为97.55%，与我国QX代表株P100 同源性为93.31%。此外，该分离株与韩国SNU-11045 株、SNU-8065 株亲缘关系较近，而这两株毒株均为2005 年分离的QX 肾型毒株[17]。因此，可以确定本试验分离株为我国优势基因型QX 型。广西、山西、山东、江苏等地在2008—2020 年多次对分离出的本地毒株进行基因分析，结果发现本地流行毒株70%以上为QX型[10-11，13-14]，说明在宁夏流行的优势IBV 基因型与我国其他多个省份流行的优势基因型相同。目前我国常使用的疫苗血清型有H120、H52 及H41 型，都属于Mass 基因型[18]。Mass 型是我国目前运用最广泛、效果最好的疫苗基因型，但与宁夏分离株同源性较低，由此推测我国常用的Mass 型疫苗对本试验分离株难以产生有效的免疫保护作用，这可能是导致疫情发生的主要原因。

综上建议：继续进行IBV 流行病学监测，对外来引进鸡群要做好引种检疫工作，防止外来病原入侵；在此病高发的秋冬季节，更要重视对该病的防控；针对本地疫情流行状况，及时使用高效疫苗进行预防，从而减少养鸡户经济损失。

致谢：

本研究得到了宁夏动物疾病预防控制中心王晓亮研究员和南京农业大学在读博士生程肖晔、左冉坤的帮助。