不同磷浓度对土壤理化性质及防风生长和药材品质的影响

郝 佳，刘宇航，殷 洁，刘 晶，田 新，韩忠明，王云贺，韩 梅，杨利民

(吉林农业大学 中药材学院/吉林省生态恢复与生态系统管理重点实验室,吉林 长春 130118)

土壤理化性质是衡量土壤综合生产力的重要指标，对作物产量和品质起着关键性作用，研究表明，土壤有效养分(尤其是土壤碱解氮、有效磷和速效钾)与作物品质及养分吸收量间存在一定的相关关系[1]。对药用植物而言，土壤养分是影响药材产量和品质的重要环境因子。在实际生产过程中发现，尤其在逆境条件下，药用植物栽培前后土壤养分变化非常明显[2-3]，导致药材质量也具有一定差异。磷素是植株生长所需的大量元素之一，主要作用是促进根系生长和果实发育，但在我国乃至全球的环境下，磷素一直处于严重匮乏的状况，研究表明，当磷供给不能满足植物生长时，会出现植株新陈代谢受阻、生长繁殖迟缓、对环境的不良刺激抗逆性变弱等症状[4]。当土壤全磷质量分数低于0.03%时，土壤往往表现缺少有效磷。因此，在磷胁迫下，植物会形成一系列的响应策略，同时土壤养分含量的变化反过来影响着药用植物的生长发育及药材质量。

防风Saposhnikovia divaricata是我国常用大宗中药材之一，以未抽薹的干燥根入药，具有解表祛风、胜湿、止痉等作用[5]，其主要药效成分为色原酮类，主要包括升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷等[6-8]。近年来，对防风的水分、光照以及化学成分等方面研究较多[8-11]，而不同磷浓度处理对防风影响的研究鲜见报道。本研究以2年生防风为试验材料，就不同磷浓度对防风生长特性、4种色原酮总含量及土壤理化性质的影响开展研究，揭示防风对低磷环境的响应，旨在为吉林省西部缺磷环境条件下防风人工栽培技术策略的制定以及防风对低磷环境响应机制的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在吉林省长春市吉林农业大学人工气候室内，采用室内圆柱沙培的方式进行试验，柱高50 cm，口径10 cm，每桶装洗净的沙子3.3 kg，沙子的有效磷、速效钾、碱解氮质量分数分别为0.05、47.06、22.15 mg/kg，有机质质量分数为 0.57 mg/g。2019年6月播种，期间保证水分充足，7月齐苗后，每柱定苗1株。

1.2 试验设计

参考全国以及分布区内防风土壤中有效磷含量，试验共设计了3个磷浓度处理，采用Hoagland营养液浇灌[12-13]的方式供应营养液，营养液的磷(NH4H2PO4) 浓度分别为 1.0、0.1 和 0 mmol/L，其他营养元素供应均相同。2020年6月15日开始供应营养液，每个处理的营养液浇灌时间均相同，每10天1次，每柱浇灌营养液100 mL，每个处理设置 50 柱。分别于处理 30 、60 和 90 d 采土样，每个处理随机取防风10株。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤指标测定 将土壤自然晾干后，过筛，pH、电导率 (κ) 采用pH计法测定，有机质含量采用重铬酸钾容量法测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，有效磷含量采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾含量采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定[14]，酸性磷酸酶活性采用苯磷酸二钠法测定[15]。

1.3.2 生长指标测定 防风样品置于冰盒中带回实验室，用流水迅速清洗干净，吸干表面水分，分别测量防风根长、根粗，并称量根鲜生物量，烘干后称量根干生物量。

1.3.3 4种色原酮总含量测定 将干燥的防风根用粉碎机粉碎，过100目筛，精确称取0.5 g样品，加入φ为70%的乙醇15 mL，在微波萃取仪中，90 ℃条件下提取 3 min，收集滤液，采用 Agilent 1 260 高效液相色谱仪测定4种色原酮的总含量，4种色原酮分别为升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷。色谱条件：色谱柱为 Diamonsil C18(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，柱温 30 ℃，检测波长 254 nm。甲醇-水梯度洗脱：0～15 min，φ为 20%～45% 的甲醇；15～25 min，φ为 45%～70% 的甲醇。流速 1 mL/min[6,16]。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 2010对原始数据进行整理，采用DPS12.01统计软件对数据统计分析，使用 Origin 9.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同磷浓度对防风土壤理化性质的影响

2.1.1 不同磷浓度对防风土壤养分含量的影响如图1所示，土壤pH(图1A)在处理30 d时3种磷浓度处理间存在显著差异，无磷处理的pH 显著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷处理，随着处理时间的延长，60 d 时 0.1 mmol·L-1和无磷处理的 pH 显著降低，较 30 d 时分别降低了约 12%，90 d 时 0.1 mmol·L-1和无磷处理的 pH 显著低于 1.0 mmol·L-1磷处理，分别降低了7%和12%，3种处理间差异显著。土壤电导率 (图1B) 在整个试验期间表现为 1.0 mmol·L-1磷处理显著高于无磷处理，在 30、60 和 90 d 时分别为无磷处理的2.14、1.64 和2.03 倍。土壤有机质含量(图1C) 在整个试验期间表现为无磷处理显著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷处理，在 30、60 和 90 d时，无磷处理的土壤有机质含量较1.0 mmol·L-1磷处理分别提升了 1.23、0.72 和 1.63 倍，较 0.1 mmol·L-1磷处理分别提升了0.78、0.74和0.61倍。

处理30 d时土壤碱解氮含量(图1D)表现为无磷处理显著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷处理，60 d时3种处理间无显著差异，90 d 时各处理的碱解氮含量均升为最大值，且无磷处理显著高于1.0和0.1 mmol·L-1磷处理，分别为 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷处理的1.35和1.44 倍。土壤有效磷含量(图1E) 在处理 30 和 60 d 时表现为 0.1 mmol·L-1和无磷处理显著低于 1.0 mmol·L-1磷处理，且分别较 1.0 mmol·L-1磷处理下降了约 34% 和63%，随着处理时间的延长，90 d时的土壤有效磷含量积累到最大值，且0.1 mmol·L-1磷处理显著高于无磷处理。0.1 mmol·L-1和无磷处理的速效钾含量(图1F) 在整个处理期间无显著差异，在 30 d 时 1.0 mmol·L-1磷处理的速效钾含量显著高于 0.1 mmol·L-1和无磷处理。

图1 不同磷浓度对防风土壤理化性质的影响Fig. 1 Effects of different phosphorus concentrations on physicochemical properties of soil in which Saposhnikovia divaricata was grown

2.1.2 不同磷浓度对防风土壤酸性磷酸酶活性的影响 磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向及强度的指标，酸性磷酸酶参与有机磷的转化，因此被认为是研究低磷胁迫下磷代谢的重要酶[17]。如图2可知，2年生防风根系土壤中酸性磷酸酶活性在处理 30 d 时为无磷处理＞0.1 mmol·L-1磷处理＞1.0 mmol·L-1磷处理，3 种处理间存在显著差异，处理60 和90 d时3种处理间无显著差异。因此，试验初期，缺磷 (0.1 mmol·L-1和无磷)处理下，防风增加酸性磷酸酶的分泌，以此转化更多的无机磷供自身吸收利用。

图2 不同磷浓度对防风土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig. 2 Effects of different phosphorus concentrations on acid phosphatase activity of soil in which Saposhnikovia divaricata was grown

2.2 不同磷浓度对防风生长的影响

如图3可知，根长(图3A)在处理30 d时3种磷浓度无显著差异，处理60 d时无磷处理的根长显著高于 0.1 mmol·L-1磷处理，90 d 时无磷处理的根长显著高于 1.0 和 0.1 mmol·L-1磷处理，均高出12% 左右。根粗(图3B) 表现为在整个试验期间1.0 mmol·L-1磷处理高于 0.1 mmol·L-1和无磷处理，30 d 时 1.0 mmol·L-1磷处理与无磷处理之间存在显著差异，根粗增加，3种磷水平间差异缩小；根鲜生物量 (图3C)在处理 30 d 时 1.0 mmol·L-1磷处理显著高于 0.1 mmol·L-1和无磷处理；根干生物量 (图3D) 在整个试验期间表现为 1.0 mmol·L-1磷处理显著高于无磷处理。说明，磷胁迫(无磷处理)下2年生防风地下部分生长受到了限制，根生物量显著降低。

图3 不同磷浓度对防风生长的影响Fig. 3 Effects of different phosphorus concentrations on growth of Saposhnikovia divaricata

2.3 不同磷浓度对防风药材品质的影响

由图4可以看出，处理30和60 d时防风4种色原酮总含量在3个磷浓度间无显著差异，处理90 d时 0.1 mmol·L-1和无磷处理的 4 种色原酮总含量显著高于1.0 mmol·L-1磷处理，且分别高出59%和46%。结果表明，防风在长期的磷胁迫下，会通过增加次生代谢产物色原酮来适应外界环境。

图4 不同磷浓度下防风4种色原酮总含量变化Fig. 4 Changes in total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata in different phosphorus concentrations

2.4 土壤理化性质、防风生长指标与4种色原酮总含量的相关关系

2.4.1 相关性分析 不同磷浓度处理下土壤理化性质、防风生长指标和4种色原酮总含量的相关关系见图5，从图5中可以看出，1.0 mmol·L-1磷处理下，碱解氮、有效磷含量与4种色原酮总含量存在极显著负相关(P＜0.01)，根长与4种色原酮总含量呈显著正相关(P＜0.05)，根鲜质量与4种色原酮总含量呈正相关，其他各指标均与4种色原酮总含量呈负相关；0.1 mmol·L-1磷处理下，pH、碱解氮含量、酸性磷酸酶活性与4种色原酮总含量呈正相关，其他指标均与4种色原酮总含量呈负相关；无磷处理下，碱解氮、有效磷含量和根鲜生物量与4种色原酮总含量呈正相关，其他指标与色原酮含量存在负相关。

图5 不同磷浓度下的土壤理化性质、防风生长指标与4种色原酮总含量的相关关系Fig. 5 Correlation between soil physicochemical property,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

2.4.2 灰色关联度分析 表1为不同磷浓度处理下土壤理化性质、防风生长指标与4种色原酮总含量的灰色关联度矩阵。从表1中可以看出，1.0 mmol·L-1磷处理下，各因子与4种色原酮总含量的关联系数在0.270～0.496之间，与4种色原酮总含量的关联系数最大的为根长；0.1 mmol·L-1磷处理下，各因子与4种色原酮总含量的关联系数在0.297～0.459之间，与4种色原酮总含量的关联系数最大的为酸性磷酸酶活性；无磷处理下，各因子与4种色原酮总含量的关联系数在0.292～0.524之间，pH和根长是与4种色原酮总含量关联系数最大的2个因子，分别为0.524和0.500。

表1 不同磷浓度下的土壤因子、防风生长指标与4种色原酮总含量的灰色关联度分析Table 1 Grey correlation analysis between soil factors,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

2.4.3 通径分析 通径分析可将相关系数分解为直接作用和间接作用，从而清楚地显示各因素的相关关系。从表2中可以看出：1.0 mmol·L-1磷处理下，电导率、根粗、根鲜生物量对防风4种色原酮总含量的直接通径系数为正值，有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量及酸性磷酸酶活性、pH、根长、根干质量对防风4种色原酮总含量的直接通径系数为负值；0.1 mmol·L-1磷处理下，仅有根鲜质量对防风4种色原酮总含量的直接通径系数为正值，其他指标均为负值；无磷处理下，有机质和碱解氮含量及根长、根鲜质量对防风药材4种色原酮总含量的直接通径系数为正值，pH、电导率、酸性磷酸酶活性、根粗、根干质量以及有效磷和速效钾含量对防风药材品质的直接通径系数均为负值。

表2 不同磷浓度下的土壤理化性质、防风生长指标与4种色原酮总含量的通径系数1)Table 2 Path coefficient between soil factors,growth index with total content of four chromones of Saposhnikovia divaricata under different phosphorus concentrations

从间接通径系数来看，1.0 mmol·L-1磷处理下，x10(速效钾含量)→(通过)x6(电导率)→y(4种色原酮总含量)、x11(酸性磷酸酶活性)→x6→y、x7(有机质含量)→x6→y的间接通径系数为正，且位列前3，分别为 0.362、0.350 和 0.333；x9(有效磷含量)→x8(碱解氮含量)→y、x11→x10→y、x9→x5(pH)→y的间接通径系数为负，且其绝对值位列前3，分别为-0.444、-0.192、-0.139。

0.1 mmol·L-1磷处理下，x10→x5→y、x5→x6→y、x6→x5→y的间接通径系数为正，且位列前3，分别为0.391、0.390、0.369；x10→x6→y、x11→x6→y、x7→x6→y的间接通径系数为负，且其绝对值位列前3，分别为-0.507、-0.380、-0.315。

无磷处理下，x5→x2(根粗)→y、x11→x9→y、x6→x5→y的间接通径系数为正，且位列前3，分别为0.994、0.942、0.840；x4(根干生物量)→x2→y、x3(根鲜生物量)→x2→y、x6→x2→y的间接通径系数为负，且其绝对值位列前3，分别为-0.710、-0.588、-0.567。

3 讨论与结论

植物的生长发育与土壤养分含量密切相关[18]，除受自身遗传因素控制外，药用植物生长特性、药效成分与土壤养分也密切相关，药效成分多为次生代谢产物，是植物与环境在长期进化过程中相互作用的结果，更加容易受到外界环境的影响。磷素是影响植物生理活动的重要生态因素，土壤中的磷素有效性高低与土壤对磷的吸附-解吸、沉淀-溶解等过程有关，而这些过程又取决于气候条件、土壤理化性质等因素[19]。前人研究发现，进入土壤中的磷素有效性不仅受土壤理化性质影响，反过来低磷或缺磷的环境下，植物根系也会启动一系列的觅磷策略，从而抵御不良环境，例如增加有机酸的分泌，通过其络合或螯合作用活化土壤中难溶的营养成分供自身吸收利用，反过来也影响土壤理化性质[20]，或者改变根系生物量及形态特征，从而影响根系对营养成分的吸收。

本研究发现，防风根系土壤pH在7.04～7.99之间，呈弱碱性，处理30 d 时无磷处理的pH显著高于1.0和0.1 mmol·L-1磷处理，随着处理时间延长，60 和 90 d 时 0.1 mmol·L-1和无磷处理的 pH 降低，且显著低于 1.0 mmol·L-1磷处理，90 d 时更是表现出3 种处理间pH存在显著差异。pH是影响植物对土壤中难溶磷进行活化的重要因素，有学者研究表明，在一定范围内，随着根际土壤pH的下降，植物对磷的吸收会显著增加[21]，本研究结果表明，0.1 mmol·L-1和无磷处理下 2 年生防风处于缺磷状态，要通过提高自身对土壤中磷的获取，才能满足植株的生长以及各项生理活动对磷的需求，因此0.1 mmol·L-1和无磷处理下防风根系不断分泌有机酸等物质，导致处理后期低磷胁迫下土壤pH显著低于 1.0 mmol·L-1磷处理，这与刘晓霞[22]、谢安强等[23]的研究结果一致。植物根系分泌物和土壤pH的相互作用之间存在动态平衡，并受多方面因素共同调节，Chen等[24]提出有机质、碱解氮等物质含量与维持土壤微生态平衡之间关系密切，本研究发现，防风在磷胁迫下，土壤有机质、碱解氮含量积累增加，这可能是一方面低磷环境使得土壤中微生物的数量和活性受到了抑制，因此减缓了有机质等的消耗，另一方面，也可能是有机酸和其他螯合剂的分泌增多，将土壤中难溶的部分释放为可溶态，因此使土壤中的速效养分含量增多，同时， 0.1 mmol·L-1和无磷处理在长时间的磷胁迫下，防风根系可吸收的磷不足，根表面积和生物量减小，进一步抑制了根系对氮的吸收，导致无磷处理下防风根际土壤中碱解氮的含量显著高于其他2个处理，这与李荣坦[25]研究结果相一致。

酸性磷酸酶是重要的水解酶，也是诱导酶，它不仅在植物碳水化合物转化及蛋白质合成中起重要作用，还与土壤中有机磷的分解和再利用有密切联系。徐静等[26]研究表明，大麦根际土壤酸性磷酸酶活性在不施磷以及磷质量分数为30 mg/g的土壤中显著高于磷质量分数为90 mg/g的土壤。本试验通过分析发现，防风根系土壤中酸性磷酸酶活性在处理 30 d 时表现为无磷处理＞0.1 mmol·L-1磷处理＞1.0 mmol·L-1磷处理，说明试验初期防风在低磷环境下酸性磷酸酶分泌增多，使得土壤中酸性磷酸酶活性提高，从而提高防风对低磷环境的适应性。

无磷处理下，2年生防风的根粗、根生物量在整个处理期间均低于1.0 mmol·L-1磷处理，这与郭轶敏等[27]研究结果低磷胁迫下柱花草Stylosanthes guianensis的生物量总体呈下降趋势相一致，但是无磷处理下防风的根长随着处理时间的延长逐渐增加，在处理3个月时显著高于1.0 mmol·L-1磷处理，说明2 年生防风长期在无磷胁迫处理下，为满足自身生长需求，通过增加根长来增加与土壤的接触面积，吸收更多的养分，这与Liu等[28]研究结果相一致，即植物可以通过增加根长来提高植株对低磷胁迫的耐受。

中药材药效成分的含量由遗传因素和环境因素共同决定，遗传因素决定其是否具有合成药效成分的能力，而环境因素决定其药效成分的含量高低[29]。韩忠明等[8]研究发现，适当的逆境胁迫有助于提高中药材有效成分含量及药材品质。本研究结果表明，在整个处理期间，0.1 mmol·L-1和无磷处理下防风的 4 种色原酮含量高于 1.0 mmol·L-1磷处理，特别是 90 d 时，0.1 mmol·L-1和无磷处理的 4 种色原酮含量显著高于1.0 mmol·L-1磷处理。相关性分析和灰色关联度分析表明，1.0 mmol·L-1磷处理下，碱解氮和有效磷含量与4 种色原酮总含量存在极显著负相关关系，与通径分析结果相一致；0.1 mmol·L-1磷处理下酸性磷酸酶活性是影响4 种色原酮总含量的最大因子；无磷处理下土壤pH和根长是与4种色原酮总含量关联系数最大的2个因子，通径分析结果进一步确定了根长对防风4种色原酮总含量是正向促进作用，土壤pH对防风4种色原酮总含量是负向作用。说明低磷胁迫下，防风通过改变代谢途径维持其基本生长的需要，根长增加、有机酸的释放以及酸性磷酸酶的分泌致使pH降低，从而促进磷素的吸收、转运和有效利用，进而影响防风次生代谢水平，因此土壤pH对防风4种色原酮总含量的影响是负向作用，而根长对防风4种色原酮总含量的影响是正向促进作用。

3种磷浓度下防风生长状况、土壤理化性质与4种色原酮总含量之间并不是简单的相关关系，它们通过协同作用共同维持防风正常生长，以减轻低磷胁迫给防风造成的危害。因此，防风面对磷胁迫有一系列的响应机制，在磷胁迫下，防风对土壤有机质和碱解氮的吸收利用减弱，但通过增加根长及有效成分总色原酮的含量，在试验初期增加酸性磷酸酶的分泌，从而改变土壤的pH、活化土壤中难溶的营养成分供自身吸收利用，以提高对低磷环境的适应性。本研究结果能够为防风人工栽培技术策略的制定以及防风对低磷胁迫响应机制的研究提供理论依据。但本研究仅限于室内盆栽试验，试验结果需进一步开展大田试验研究进行验证。