“中风1号”对急性脑出血大鼠PI3K/Akt信号转导通路、GSK-3β蛋白表达的影响*

梁 群 杨 洋 李 帅 潘郭海容 朱永志△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

脑出血（ICH）又称出血性卒中，随着年龄的增长脑出血发生的风险明显增加，但目前50岁以下的发病率稳定上升，占比逐渐增大，治疗及预后并没有得到明显改善[1-2]。近期的研究多集中于出血性卒中病理机制的研究，以期为临床治疗寻找潜在的靶点，但由于其复杂性和局限性，进展一直有限[3]。

有研究显示，神经损害是脑出血发生后出现的脑水肿、氧化应激等继发性脑损伤导致的，神经元是患者神经功能恢复的重要因素[4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号转导通路对神经细胞增殖、分化、抑制凋亡意义非凡，对血管新生亦十分重要[5]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它的高表达可加重神经元的损伤，且GSK-3β的促凋亡作用此前已被证明通过PI3K/Akt信号转导通路途径负调控[6]。“中风1号”是一种用于出血性中风急性期的中药方剂，本研究将其应用于脑出血模型大鼠，通过观察其对PI3K/Akt信号转导通路、GSK-3β蛋白表达的调控，来探索中医、中药对出血性卒中治疗的可行性，进一步探讨其作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级别体质量200～240 g的SD雄性大鼠40只，购于黑龙江中医药大学动物实验中心。在自然光线的实验室使用普通专用饲料喂养，温度（22±4）℃，相对湿度40%～70%，经过1周适应性饲养后进行实验，操作过程及处死方式遵循国际通用实验动物使用指南。

1.2 实验药物 中风1号，组方：水蛭10 g，泽泻10 g，三七粉10 g，生大黄5 g，生地黄5 g，饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室。大鼠用药灌胃量按动物体表面积比率计算[7]，水煎至每毫升含药3.5 g（3.5 g/mL）。20%甘露醇注射液，石家庄四药有限公司生产，规格50 mL/瓶，国药准字H1302303。

1.3 试剂与仪器 Western blotting一抗二抗去除液（P00258 Beyotime）；完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂（04693159001Roche）；5×Protein Loading Buffer（B130043 Biosntech）；Page ruler prestained protein ladder（26617 Thermo）；RIPALysis Buffer（P00013B Biosntech）；SDSPAGE凝胶配制试剂盒（BL508A Biosharp）；TrisBase（T1378 Sigm）；Glycine（NC-S0002-500纳川）；Sodium dodecyl sulfate（NC-0227-500纳川）；封闭专用脱脂奶粉（P1622普利莱）；Tween20（0777 Amresco）；Western HRP Substrate（NC-WBLUR0500F Millipore）；异丙醇、甲醇（西陇化工）；电泳仪（042BR13724 Bio-Rad）；低温离心机（SORVALLST8/8R Thermo）；转膜仪（221BR52130 Bio-Rad）；酶标仪（MULTISKANFC Thermo）。

1.4 分组与造模 将40只SD大鼠随机分为4组，每组10只。分别为假手术组、模型组、中风1号组、甘露醇组，将1∶10的水合氯醛粉剂与生理盐水混合，振摇至完全溶解，按400 mg/kg注射于大鼠腹腔，约8～10 min后，用镊子轻夹大鼠四肢，确定大鼠进入麻醉状态，将其俯卧固定于立体仪上，头部毛发剃除，常规备皮，前囟抬高约1 mm，以碘伏消毒，在头部正中割2.5 cm纵形切口，使用扩皮器牵开切口，在前囟点右侧3.5 mm，再延矢状面在后侧0.2 mm处取点，牙钻钻孔，深及骨膜，有镂空感即止[8]。注射器抽取大鼠尾部动脉血（血量＞70 μL）后，迅速用微量注射器抽取60 μL，并将其固定于定位仪，使微量注射器针头垂直于颅骨圆孔，进针深约6.0 mm，将动脉血缓慢注入大鼠脑内，时间约为2 min，留针10 min以防血液倒流，缓慢退针，牙科水泥封孔，缝合手术创面，为防感染，于缝合处覆盖少量青霉素钠粉末[9]。假手术组不注入动脉血，只做开颅、钻孔。

1.5 给药方法 首次给药时间为术后24 h，参考成人剂量与人体质量的折算系数比例公式来计算大鼠用药量，且已于前期实验研究确定用药剂量。模型组、假手术组：生理盐水1.5 mL灌胃，生理盐水1 g/kg尾静脉注射，每日2次。中风1号组：中药汤剂1.5 mL灌胃，生理盐水1 g/kg尾静脉注射，每日2次。甘露醇组：生理盐水1.5 mL灌胃，甘露醇1 g/kg尾静脉注射，每日2次。各组持续给药7 d。

1.6 神经行为学评分 于术后24 h（给药前）、3、7 d进行神经功能评分，采用改良版的神经功能缺损评定标准（mNSS）[10]进行评分，分值0～18分。

1.7 Western blotting检测 术后第8天予乙醚麻醉后，断头处死大鼠，取血肿区的脑组织20 mg，提取蛋白，取20～40 μg蛋白溶液RIPALysisBuffer补齐一致，加入5×Protein Loading Buffer，金属浴100 ℃，5 min。取含20 μg蛋白的溶液上样，电泳、转膜、封闭，一抗、二抗，ECL显色，置于全自动化学发光图像分析系统扫描。

1.8 统计学处理 应用SPSS25统计软件。计量资料以（）表示。计量资料采用独立样本t检验（不符合正态性采用非参数检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 见表1。术后24 h，与假手术组比较，各造模组神经功能评分明显升高（P＜0.05），而模型组、中风1号组、甘露醇组分别两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05），证明造模成功。术后3、7 d，各造模组与假手术组比较评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），中风1号组、甘露醇组分别与模型组比较评分明显降低（P＜0.05），提示中风1号能改善脑出血后大鼠的神经功能。

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能评分比较（分，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别模型组假手术组中风1号组甘露醇组n 8 8 8 8术后24 h 11.6±1.5*1 11.2±1.8*10.9±1.6*术后3 d 15.7±1.8*1 13.8±1.6*△11.8±1.2*△术后7 d 15.4±1.7*1 11.6±1.9*△9.2±1.4*△

2.2 各组大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表达水平比较 见表2，图1。与假手术组相比，模型组PI3K、Akt蛋白表达均显著降低（P＜0.05），GSK-3β蛋白表达显著增高（P＜0.05）。与模型组相比，中风1号组、甘露醇组PI3K、Akt蛋白表达均显著上升（P＜0.05），GSK-3β蛋白表达显著下降GSK-3β（P＜0.05）。而中风1号组与甘露醇组相比，PI3K、Akt蛋白表达有明显差异（P＜0.05），GSK-3β蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相对表达量比较（±s）

注：与中风1号组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01。

组别模型组假手术组中风1号组甘露醇组n 8 8 8 8 PI3K 0.701±0.035*1.159±0.038 0.819±0.054*△0.945±0.055*△△▲Akt 0.748±0.046*1.245±0.046 0.882±0.059*△1.028±0.072*△△▲GSK-3β 1.717±0.075*1.287±0.040 1.556±0.073*△1.480±0.079*△

图1 各组大鼠脑组织PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表达

3 讨 论

脑血管病变是脑出血发病的主要原因，在脑出血发生后，脑血肿及脑组织在破坏过程中所释放的炎症因子、毒性因子导致了神经细胞的凋亡和神经纤维的断裂[11]。如何抑制神经细胞凋亡，减轻神经功能缺陷，成为改善临床患者治疗及预后的研究重点。脑出血发生后会释放出神经细胞生长因子等具有络氨酸酶活性的物质，这种活性物质会特异性地结合PI3K的调节亚基，使PI3K下游效应分子Akt获得催化[12]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K下游效应的主要中介，协调多种胞内信号，控制细胞对外界刺激的反应，Akt被激活后可以使下游靶向蛋白磷酸化，发挥抗凋亡作用[13]。有研究显示，大脑中动脉闭塞后5 h在缺血病灶区神经元可测到磷酸化Akt[14]，由此可见PI3K/Akt信号转导通路在细胞新陈代谢、增殖、凋亡中起到重要的作用，和神经功能损伤密切相关。GSK-3β是Akt信号通路下游的重要靶点，是细胞保护信号通路的会聚点，在调节神经元极性、神经炎症和神经退行性紊乱等方面有重要意义[15]，进一步激活GSK-3β的促凋亡作用，可加重神经细胞损伤[16]，由此可见GSK-3β在中枢神经系统慢性和急性疾病的发病机制中发挥着关键作用[17]。越来越多的研究表明，能够激活PI3KAkt信号转导通路，并抑制GSK3β蛋白活性的药物可以在脑出血发生后起到神经保护的作用[18]。

脑出血在中医学属“中风-中脏腑闭证-阳闭”的范畴，基本病机为脏腑阴阳失调、气血逆乱。逆乱的气血上冲至脑，使神窍闭阻，血菀脑腑，髓破血溢。多由内伤积损，产生瘀血、痰火、肝风、风火，加之外邪侵袭、情志不遂、饮食不节、劳逸过度等因素诱发[19]。中医中药从整体出发，在脑出血的治疗及预后贡献了一定的作用，说明中医药在这一领域具有独特的优势。“中风1号”是全国名中医药专家传承工作室指导教师朱永志教授多年治疗急性脑出血临床经验的总结，由水蛭、泽泻、三七粉、生大黄、生地黄配伍而成，化痰祛风，以使血脉畅通、祛瘀生新、消浊祛痰，以达到标本兼治的目的[20-21]。甘露醇注射液是临床抢救脑部疾患常用的一种降低颅内压的高渗降压药，在其进入体内后能迅速提高血浆渗透压，使组织脱水，降低颅内压、眼内压，经肾小球滤过后，不易被肾小管重吸收，增加尿渗透压，可带出体内大量水分，减轻脑水肿，因此选作对照用药。

本研究建立脑出血大鼠模型，观察术后24 h、3 d、7 d神经功能损伤评分，发现“中风1号”可以有效缓解大鼠脑出血后神经功能的损害，虽与甘露醇组有一定差距，但也是具有显著效果的。Western blotting检测发现“中风1号”对PI3K/Akt、GSK-3β蛋白表达的有调控作用，可以有效提高PI3K、Akt的蛋白表达，降低GSK-3β的蛋白表达。因此我们假设“中风1号”可以通过激活PI3K/Akt信号通路，来抑制GSK-3β的促凋亡作用，以达到减少神经细胞凋亡、减轻脑出血后神经功损伤，改善预后的目的。从研究中可以看出“中风1号”在调控PI3K、Akt蛋白表达方面发挥了较为明显的作用，但与甘露醇的调控效果还具有一定差异，可在抑制GSK-3β蛋白表达方面与甘露醇无明显差异，究竟是什么原因使“中风1号”在调控GSK-3β蛋白表达上能力更突出，有待进一步研究。