基于Hippo-YAP信号通路探讨桃红四物汤对BMSCs增殖与成骨分化的影响*

周文佳 尚云峰 朱文新 杨 卓 卢雪笛 申 楠 向黎黎 陆小龙△ 熊 辉（.湖南省岳阳市中心医院，湖南 岳阳 000；.湖南省常德市第一中医院，湖南 常德5000；.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 0005；.湖南中医药大学，湖南 长沙 0007）

骨折可通过手术或者复位后愈合，但仍有5%～10%的临床患者在治疗后出现骨不连[1]，不愈合引起的疼痛，肢体功能障碍和心理障碍给患者和家庭带来的痛苦是巨大的，增加了家庭和社会的经济负担[2]。传统的手术治疗方法包括去除变硬的骨头、清洁未连接的末端组织、切髓腔、固定或骨移植[3]，但对于萎缩性骨不连，治疗效果却不如人意。尽管在临床中可以通过简单的压迫或药物来促进骨折愈合，但其愈合机制仍不清楚。中医药在治疗骨折方面具有独特优势，以桃红四物汤为代表的方剂在治疗临床骨不连及促进骨折愈合的方面疗效显著，但其内在作用机制仍不够明确。为了进一步探索骨折的不愈合和愈合的机制，许多学者在细胞生物学和分子生物学方面进行了相关研究，其中以骨髓间充质干细胞（BMSCs）与Hippo-YAP信号通路两个靶点最受关注。本研究从实验角度进一步论证桃红四物汤促进骨折愈合的分子机制，为其临床应用和潜在开发提供有价值的理论依据以及实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠10只，雌雄不拘，远交系，清洁级，用于分离骨髓间充质干细胞；Wistar大鼠共40只，雌雄各半，体质量（250±10）g，用于含药血清的制备；实验动物均由湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.2 试药与仪器 桃红四物汤汤剂由湖南中医药大学附属第二医院药剂科提供，根据《医宗金鉴》记载，并规范为现代超微颗粒药物剂量，主要成分：桃仁20 g，红花10 g，生地黄20 g，赤芍20 g，川芎10 g，当归20 g。DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，多聚甲醛、胰蛋白酶购自上海宝曼公司，茜素红、双抗、CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒购自北京雷根公司，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、30%甲叉双丙烯酰胺购自上海伊塔生物科技公司，Verteporfin购自上海雅吉生物科技，过硫酸铵、甘氨酸、枸橼酸钠、水合氯醛购自上海生工，PVDF膜、5%脱脂奶粉购自北京沃凯生物科技，RealBand蛋白预染Marker、超敏ECL化学发光试剂盒购自苏州新赛美，BeyoCoLorTM彩色预染蛋白、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（强）、20×TBS缓冲液购自上海碧云天公司。桃红四物汤含药血清的制备：桃红四物汤以0.3㎏大鼠的给药剂量为0.36 g/d灌胃，对照组0.9%氯化钠注射液等体积灌胃，制备血清灭活补体后，低温冰箱保存备用。大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分离及培养：将实验大鼠麻醉断颈处死，95%酒精浸泡2 h，分离大腿股骨及胫骨，用基础培养基冲洗股和胫骨髓腔，收集冲洗液，补充含20%胎牛血清及1%链霉素。然后，将骨髓细胞悬液通过70 μm细胞过滤器过滤，通过300 r/min的离心机分离，会出现上层清液及下层沉淀物质，取下层。加双倍血清和双抗，24 h后观察细胞贴壁情况，弃掉未贴壁细胞悬液，将培养物保持在37℃、5% CO2的培养箱中。每2天更换1次培养基，直到细胞亚融合，融合程度达到80%及胰蛋白酶被消耗后，按照1∶2比例培养，传代。将培养的第3代BMSCs用于实验。

1.3 分组及干预 将所培养的BMSCs细胞置于含15%胎牛血清的DMEM/F12低糖培养基中，37℃、5% CO2饱和湿度下培养。用培养液将细胞浓度调整为1×106/L，细胞状态良好时接种于96孔培养板。将96孔培养板上的细胞随机分为3组，空白血清组、桃红四物汤含药血清组（THSWT组）、桃红四物汤含药血清+Verteporfin组（THSWT+V组）。各组细胞干预方法：待细胞融合2 d后，加入含药血清开始进行干预。空白血清组：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培养基+空白血清进行培养。THSWT组：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培养基+桃红四物汤含药血清进行培养。THSWT+V组：15%胎牛血清+DMEM/F12低糖培养基+桃红四物汤含药血清+Verteporfin进行培养。

1.4 标本采集与检测 1）细胞增殖活力检测实验（CCK-8实验）：将BMSCs置于无血清DMEM培养皿中饥饿24 h，然后在含有1% FBS的正常DMEM培养皿中培养，培养完成后，向孔板中加入定量CCK-8试剂溶液均匀，然后将培养皿转移到37℃、5% CO2饱和湿度下继续培养，2 h后检测。在第0、1、3和7天通过CCK-8测定法分析BMSCs细胞增殖能力。2）碱性磷酸酶检测实验（ALP）：干预结束后，根据ALP试剂盒提供的方案进行ALP测定，比较使用不同方法干预BMSCs后的结果。3）茜素红染色实验：干预21 d后，将BMSCs置在培养皿中用缓冲液浸洗3次；4%多聚甲醛中固定30 min，缓冲液浸洗3次，茜素红染色液染色20 min；染色完毕后冲洗，然后在光镜下可观察到橘红色的钙沉积阳性细胞，比较各组之间的差异。4）Western blotting实验：提取BMSCs细胞蛋白并定量。电泳，转膜，封闭后，将膜与一抗在4℃孵育过夜，然后二抗孵育，用超敏ECL化学发光试剂盒检测膜上的信号，并使用Image-J软件分析蛋白质条带的灰度值。

1.5 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件进行处理，所有数据以（）表示，所有数据均进行正态检验并符合正态性，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs免疫表型特征 见图1。流式鉴定BMSCs免疫表型特征：CD44、CD29和 CD105阳性，CD34、CD45阴性，符合BMSCs细胞特征。

图1 BMSCs免疫表型特征

2.2 CCK-8细胞增殖活力结果 见图2。对比空白组含药血清及桃红四物汤含药血清，后者干预下的BMSCs细胞增殖速度明显增快（P＜0.01），当我们使用Verteporfin阻断Hippo信号通路后，发现BMSCs细胞的增殖速度明显减慢（P＜0.01）。

图2 各组BMSCs细胞增殖活力

2.3 ALP、茜素红染色分析BMSCs骨向分化程度 见图3。ALP检测显示：BMSCs的成骨分化程度显著降低。使用Hippo通路阻断剂Verteporfin后，茜素红染色显示钙盐沉积明显减少。

图3 各组BMSCs骨向分化

2.4 Western blotting实验结果 见图4，图5。实验结果发现加入Hippo信号通路抑制剂后，成骨分化关键因子的蛋白表达明显减低（P＜0.01），但其蛋白表达高于空白血清组（P＜0.01）。桃红四物汤含药血清干预与空白组含药血清干预后的Hippo信号通路关键因子表达，结果显示YAP蛋白表达降低，TAZ蛋白表达增高（P＜0.01）。

图4 成骨因子蛋白表达

图5 Hippo信号通路关键蛋白

3 讨论

骨折是世界范围内重要公共卫生问题，老年人口比例的激增，使得发病率和住院率进一步增加，由此产生昂贵的经济成本[4-5]。高龄人群骨折后愈合变得更加缓慢和困难，这种情况导致了许多骨折患者在经历了复杂型骨折或者骨折合并其他并发症时，会出现骨缺损或者骨不连的症状[6-8]。严重的骨缺损及骨不连会导致局部肢体的萎缩和功能丧失，严重影响患者的正常生活，是造成早期残疾的重要影响因素[9]。因此，我们越来越需要开发改善骨折愈合速度以预防骨缺损和骨不连的治疗策略。

BMSCs是骨损伤细胞疗法和组织工程中最常用的干细胞[10]。当骨折发生时，骨髓间充质干细胞迁移至骨病变并分化为成骨细胞，分泌大量细胞外基质以促进骨折愈合，BMSCs的迁移和成骨分化受多种细胞信号等的调控，比如Hippo-YAP信号通路、Wnt通路、FAK通路等，提高BMSCs的成骨分化能力对于骨缺损和骨不连的治疗至关重要[11]。

桃红四物汤源自《医宗金鉴》，全方由6味药组成，皆为活血化瘀药，桃仁及红花化瘀行血，当归及川芎活血行血，辅之熟地黄、芍药活血柔血。本课题组对桃红四物汤开展了许多临床及实验研究，其中临床研究结果表明：桃红四物汤能促进早期及中期骨折的修复，并缩短骨折愈合时间，预防骨缺损和骨不连[12]。桃红四物汤能在骨折的不同时间段维持VEGF蛋白的高表达，并且能促进骨痂微血管的新生，从而促进骨折的愈合[13]。研究表明：VEGF蛋白的表达增高可以通过其对肌动蛋白细胞骨架的作用激活YAP，激活YAP诱导一个转录程序来进一步控制细胞骨架动力学[14]。前期的实验中也发现[15]：维持骨折断端骨痂VEGF的高水平是桃红四物汤促进骨折愈合的关键所在，也是促进BMSCs细胞迁徙、归巢的重要条件。桃红四物汤在促进VEGF表达的同时，同时也激活了Hippo-YAP信号通路。Hippo信号通路下游的YAP与TAZ共同激活RUNX2以驱动BMSCs的成骨细胞分化并抑制成脂过氧化物酶体增殖物激活的受体γ（PPAR）诱导基因转录[16-18]。

Hippo信号通路在BMSCs成骨分化过程中十分重要，YAP及TAZ蛋白在下游的关键转录作用更是必不可少，我们的实验发现，在桃红四物汤含药血清中加入Hippo信号通路阻断剂Verteporfin后，相比较没有使用Verteporfin桃红四物汤含药血清干预下的BMSCs，其增殖活力和成骨分化能力显著下降，这说明桃红四物汤在促进骨折愈合中BMSCs增殖和成骨分化的关键通路包含Hippo-YAP，Hippo-YAP信号通路介导了桃红四物汤促进骨折早期愈合的过程，其影响主要在于BMSCs细胞的增殖和成骨分化。随着细胞标记，检测技术的进一步发展，希望我们能在未来的时间中进一步探寻桃红四物汤对BMSCs的影响，为中医药的现代化研究添砖加瓦。