多鳞四指马鲅和四指马鲅种群遗传特征的研究

张 帅，李 敏，闫 帅，朱江峰，徐姗楠，陈作志

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部外海渔业开发重点实验室，广东省渔业生态环境重点实验室，广东广州 510300；2.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；3.南方海洋科学与工程广东省实验室（广州），广东广州 511548）

多鳞四指马鲅Eleutheronema rhadinum 和四指马鲅E.tetradactylum 均隶属于马鲅科Polynemidae 四指马鲅属Eleutheronema。2002 年，MOTOMURA,et al[1]根据胸鳍鳍膜颜色、有孔侧线鳞数和侧线上下鳞数等形态特征，将多鳞四指马鲅从四指马鲅中分离出来，定为另一个有效种。多鳞四指马鲅是东亚特有种，主要分布于中国的东海和南海，越南北部和日本南部偶有发现；四指马鲅的分布范围广，涵盖印度洋的波斯湾到西太平洋的巴布亚新几内亚和澳大利亚北部[1-3]。

多鳞四指马鲅和四指马鲅均为近海中上层鱼类，生长速度快，一龄鱼叉长即可达30 cm[1,4]。两者均因其肉质鲜美，营养丰富，是十分名贵的经济鱼类。与其他马鲅科鱼类似，均为雌雄同体雄性先熟[2]。多鳞四指马鲅为与四指马鲅的生态学特征也基本相似，喜栖息于底质为沙底的近岸浅滩和浑浊水域，很少进入较深的海洋中[2,4]。多鳞四指马鲅主要依赖于野外捕捞，而四指马鲅已实现人工化养殖。

目前，关于多鳞四指马鲅的研究主要集中于分类学[1-2]、生物学[5-6]、鱼类浮游生物[7-8]和种群遗传结构[9-12]等。然而关于其种群遗传结构尚无定论且均为单一分子标记，如杨阳等[10]基于AFLP 技术发现多鳞四指马鲅不同地理群体存在一定的遗传分化，而邓春兴[11]基于COI 的研究发现多鳞四指马鲅为单一种群结构。因此，本文结合常用的线粒体分子标记COI 和进化速率最快的线粒体分子标记D-loop，以东海和南海的多鳞四指马鲅以及南海的四指马鲅作为研究对象，探究两者的种群遗传多样性和遗传结构，验证COI 和Dloop 用于区分这2 种鱼的可行性，以期为这2 种渔业资源的保护和利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

样本从当地渔民或市场购买，冷冻寄回实验室（广州），-20 ℃保存。采集时间为2019 年秋季（9 月至12月），共采集多鳞四指马鲅85 尾。采样点包括东海的福州（FZ）和泉州（QZ），以及南海的珠海（ZH），同时在徐闻（XW）采集未知来源的野生四指马鲅30 尾，具体采样信息如图1 和表1。

表1 多鳞四指马鲅和四指马鲅的采样信息及遗传多样性指数Tab.1 Sampling information and genetic diversity parameters of E.rhadinum and E.tetradactylum

图1 多鳞四指马鲅与四指马鲅采样点Fig.1 Sampling sites of E.rhadinum and E.tetradactylum in south China

1.2 线粒体标记的获取

剪取鱼体背部肌肉组织15～30 mg，采用海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（天根）提取总DNA，-40 ℃保存备用。

参考四指马鲅线粒体基因全序列（GenBank 登录号：NC＿021620.1），设计并筛选出扩增2 种目标鱼类线粒体COI 和D-loop 基因序列的引物。线粒体COI 序列的扩增引物为ERCO1385-F：5′-GTTATCGTTACCGCACAT-3′和ERCO1385-R：5′-GTCAGCATTCGGATTTGG-3′。PCR 反应体系总体积为25 μL，依照KOD FX 酶（Toyobo，广州）的使用说明确定各组分的浓度。PCR 扩增反应程序：94 ℃，预变性2 min；98 ℃，变性10 s，48 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸84 s，35 个循环；68 ℃，延伸7 min。线粒体D-loop 序列的扩增引物为ERCR942-F：5′-TGTAAACCGGTTGTCGGAGG-3′和ERCR942-R：5′-GACCAAGCCTTTGTGCTTGC-3′。PCR 反应体系同线粒体COI 序列的反应体系。PCR 扩增反应程序：94 ℃，预变性2 min；98 ℃，变性10 s，55 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸56 s，35 个循环；68 ℃，延伸7 min。

PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因进行双向测序，测序引物同扩增引物。

1.3 数据分析

获得2 种线粒体标记序列后，采用软件SeqMan 拼接正反序列，根据峰图进行人工校正。采用软件BioEdit 3.3[13]编排序列，并进行格式转换。采用软件MEGA 6.0[14]对序列进行多重排列比对，参数设置为程序默认值，手动去除序列首尾使得序列长度均一。为分析徐闻采集的四指马鲅的来源，从NCBI 数据库下载马来西亚海域四指马鲅COI 序列进行分析，序列登记号为MG81629-MG81638。

采用软件MEGA 6.0 基于最大似然法筛选出最适模型和Gamma（G）值，线粒体COI 标记筛选结果为Kimura 2-parameter 模型（K2），线粒体D-loop 标记筛选结果为Tamura 3-parameter（TN92，G=0.33）；分别采用最佳模型，基于邻接法构建单倍型系统进化树，可靠性经500 次重复抽样检验；基于相应模型计算物种间的平均遗传距离。采用软件DnaSP 5.10[15]对不同地理群体进行分组，并采用软件Arlequin 3.5[16]计算不同地理群体的遗传多样性指数，包括单倍型数、多态性位点数、单倍型多样性和核苷酸多样性等。采用软件PopART 1.7[17]构建单倍型中间网络连接图[18]，并手动调整单倍型相对位置。

采用软件Arlequin 3.5 进行分子方差分析（AMOVA），检测群体变异水平与不同组间的差异显著性；遗传结构协方差的显著性通过10 000 次重复抽样来检验，并计算两两群体间的遗传分化系数（FST）；采用Exact test分析种群分化程度，通过抽样来检验显著性（10 000 次重复和100 000 马尔科夫链步骤）；采用TAJIMA′s[19]的D 检验和FU′s[20]的Fs 检验来检测种群进化是否遵循中性理论；采用核苷酸错配分布分析判断群体是否存在时空扩张。

通过T=t*代时公式来估算群体扩张时间，代时参照四指马鲅[2]，取2 年，t 为扩张以来所经历的代数。代数通过公式t=τ/2u 计算，其中τ 为扩张时间参数，由软件Arlequin 计算获得，u 为序列的突变速率（u=2 μk，μ 表示每个核苷酸位点的突变速率，k 表示目的片段长度），COI 和D-loop 核苷酸突变速率分别取每百万年1%～3%[21]和5%～20%[22]。

2 结果

2.1 序列特征

多鳞四指马鲅线粒体COI 和D-loop 序列扩增长度分别为1 289 bp 和795 bp，样本量分别为73 尾和85 尾。四指马鲅线粒体COI 和D-loop 序列扩增长度分别为1 289 bp 和890 bp，样本量均为30 尾。在多鳞四指马鲅中，COI 序列共检测到多态性位点32 个，转换位点30 个，颠换位点2 个，D-loop 序列共检测到多态性位点176 个，转换位点159 个，颠换位点18 个以及20 个缺失突变。在四指马鲅中，COI 序列共检测到多态性位点16 个，转换位点14 个，颠换位点2 个，D-loop 序列共检测到多态性位点76 个，转换位点61个，颠换位点3 个以及14 个缺失突变。

所得序列的平均碱基组成均呈反G 偏移，如多鳞四指马鲅COI 和D-loop 序列的碱基G 含量分别为20.7%和14.8%，四指马鲅COI 和D-loop 序列的碱基G 含量分别为20.0%和13.8%，该现象符合大多数脊椎动物线粒体DNA 的特征。

2.2 遗传多样性

由表1 可知，所有多鳞四指马鲅COI 和D-loop 序列的单倍型数分别为28 个和73 个，个体特异单倍型数分别为20 个（占比71.4%）和65 个（占比89%）。四指马鲅COI 和D-loop 序列的单倍型数分别为15 个和29 个，个体特异单倍型数分别为11 个（占比73.3%）和29 个（占比96.7%）。

由表1 可知，多鳞四指马鲅2 个线粒体标记均呈现高的单倍型多样性（COI：0.894;D-loop：0.994）和较低的核苷酸多样性（COI：0.002;D-loop：0.041）。四指马鲅2 个线粒体标记也均呈现高的单倍型多样性（COI：0.901;D-loop：0.998）和较低的核苷酸多样性（COI：0.002;D-loop：0.012）。

2.3 系统发育关系和种群遗传结构

由多鳞四指马鲅COI 序列的单倍型网络连接图（图2-A）和系统发育树（图3）可知，多鳞四指马鲅不同地理群体的单倍型交错在一起，呈星状发射结构，没有明显的谱系分化。基于D-loop 序列与COI 序列的研究结果基本一致（图2-B 和图3）。但D-loop 序列结果可能由于单倍型多样性高，分布较为分散，星状发射结构不明显。以上结果说明中国东海和南海的多鳞四指马鲅为单一种群遗传结构。

图2 基于多鳞四指马鲅线粒体COI 和D-loop 序列的单倍型中间网络连接图Fig.2 Haplotype median-joining network for E.rhadinum based on mtDNA COI（A）and D-loop（B）gene sequences

通过种间遗传距离可知，多鳞四指马鲅和徐闻未知来源四指马鲅具有较大的遗传差异（COI,0.071;Dloop,0.501），其中D-loop 序列的遗传差异明显高于COI 序列。结合多鳞四指马鲅和徐闻未知来源四指马鲅的单倍型系统发育树（图3）可知，多鳞四指马鲅与四指马鲅可明显分为2 支，且遗传分化显著（表2），说明本研究设计的2 种线粒体标记可用于区分这两个近缘物种。

同时，结合马来西亚四指马鲅样本COI 序列的单倍型系统发育树（图3）可以发现，徐闻未知来源的四指马鲅样本与马来西亚样本完全聚合在一支，说明该未知来源样本与马来西亚群体的亲缘关系近。

图3 基于邻接法构建的多鳞四指马鲅和四指马鲅线粒体D-loop（上）和COI（下）序列的单倍型系统发育树Fig.3 Neighbour-joining tree for mtDNA COI and D-loop haplotypes of E.rhadinum and E.tetradactylum

由表2 可知，多鳞四指马鲅COI 标记的3 个地理群体间均无显著遗传分化（P＞0.05），两两群体的遗传分化系数在-0.027 51～-0.008 97 之间；D-loop 标记的3 个地理群体间也均无显著遗传差异（P＞0.05），两两群体的遗传分化系数在-0.030 14～-0.017 06 之间。以上结果表明中国沿海的多鳞四指马鲅为单一种群遗传结构。

表2 多鳞四指马鲅两两地理群体间及与四指马鲅的遗传分化系数（FST）Tab.2 Pairwise genetic distance（FST）among geographical populations of E.rhadinum and compared with E.tetradactylum

中国南海和东海多鳞四指马鲅分子方差分析结果显示（表3），该物种的遗传变异（COI，102.83%；D-loop，103.1%）均来自种群内，且组间、组内和种群内遗传分化均不显著（P＞0.05）。表明中国南海和东海的群体为随机交配群体。

表3 多鳞四指马鲅不同地理群体遗传变异的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance of geographical populations of E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

2.4 群体历史动态

多鳞四指马鲅COI 序列和D-loop 序列的核苷酸错配分布和中性检验结果如表4 所示，可知中国沿海群体的核苷酸错配分布符合快速扩张模型和空间扩散模型的假设（P＞0.05）。由中性检验结果可知，TAJIMA’s D值均为负值，仅福州具有显著性（COI，P＜0.05），FU’s Fs 值均为负值，且都具有显著性（P＜0.05）。

表4 多鳞四指马鲅核苷酸错配分布的参数估计值和中性检验的统计值Tab.4 Mismatch distribution parameter estimates and neutrality tests statistics for E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

由2 种序列的核苷酸错配分布图（图4）可知，COI 序列的错配分布图在单个群体中以及所有群体中均为单峰型，但D-loop 序列的错配分布图均具一明显的较高单峰，同时有2～3 个小峰。

图4 基于线粒体COI（A～D）和D-loop（E～H）序列的多鳞四指马鲅核苷酸错配分布图Fig.4 The observed pairwise differences and the expected mismatch distributions under the sudden expansion model and the spatial expansion model for the mtDNA COI（A-D）and D-loop（E-H）haplotypes

通过软件Arlequin 计算获得多鳞四指马鲅COI 序列和D-loop 序列的扩张时间参数（τ）分别为1.852 和49.066，估算得出中国沿海多鳞四指马鲅的群体扩张时间分别为（2.4～7.2）万年前和（15.4～61.7）万年前。

3 讨论

3.1 群体扩张时间

通过构建系统发育树发现，COI 和D-loop 标记都可以区分多鳞四指马鲅和四指马鲅这2 个形态近似鱼种。研究发现多鳞四指马鲅和四指马鲅的分化时间在4.778 百万年前[23-24]至54.3 百万年前[25]，分歧时间较为久远。而本研究选取的2 种线粒体标记突变速率高，遗传变异较大，适用于对这2 种鱼进行分子区分。已开发用于鉴定这2 个物种的标记包括Cytb[12]、16S rRNA[12]、形态特征标记[26]、SNP 标记[26]和SCAR 标记[27]等。对未知来源四指马鲅的鉴定和溯源也验证了这2 种标记的有效性。因此，本研究拓展了鉴定多鳞四指马鲅与四指马鲅的分子标记位点，可应用于未知来源样本的鉴定和溯源。

3.2 多鳞四指马鲅的遗传多样性和历史动态

遗传多样性是鱼类适应环境和生存能力的重要基础。多鳞四指马鲅是我国近海的重要经济鱼类，关于其渔业资源状况尚无文献报道。对比以往对东海四指马鲅的研究发现，本研究样本的单倍型多样性更高（0.89 vs.0.50～0.78）[28]，可能是由于本研究涵盖了南海的样本以及扩增的COI 序列长度更长（1 289 bp vs.627 bp）。多鳞四指马鲅与其近缘物种的单倍型多样性较为接近，如本研究采集的四指马鲅为0.90，澳大利亚报道的四指马鲅为0.87[29]。多鳞四指马鲅的核苷酸多样性也与本研究的四指马鲅（0.02 vs.0.02）一致，但高于澳大利亚的四指马鲅（0.007 2）。因此，本研究结果显示多鳞四指马鲅具有较高的遗传多样性。

多鳞四指马鲅的遗传多样性指数呈现高单倍型多样性和低核苷酸多样性特征，这是种群曾经历快速扩张的典型特征[30]，普遍存在于中国近海鱼类，如黑鲷Acanthopagrus schlegelii[31]、短尾大眼鲷Priacanthus macracanthus[32-33]和日本鲭Scomber japonicus[34]等。中性检验的FU's Fs 检验结果（P＜0.05）和COI 的核苷酸错配分布图（单峰模式）也支持这一结论。这可能是由于更新世冰期和间冰期的交替出现，冰期导致栖息地减少，海洋鱼类区域性灭绝，而间冰期栖息地增加，海洋鱼类又重新扩张。在快速扩张时期，单倍型多样性快速增加，但是核苷酸多样性由突变速率决定，短时间内难以积累足够的核苷酸多样性。然而，TAJIMA's D（P＞0.05）以及D-loop 的错配分布图（多峰模式）并不支持种群快速扩张模型，这可能需要进一步的研究。综上，多鳞四指马鲅群体可能偏离中性理论下的Wright-Fisher 模型，群体历史在时空尺度上可能经历过快速扩张。

基于不同标记的多鳞四指马鲅群体扩张时间之间有较大差异，COI 标记估算的扩张时间为（2.4～7.2）万年前，而D-loop 标记的估算结果则为（15.4～61.7）万年前。邓春兴等[11]基于COI 标记估算的多鳞四指马鲅群体扩张时间为6.1 万年前，与本研究相同标记的结果基本吻合。对其他鱼类的研究也存在这一现象，如对短尾大眼鲷Cytb 和D-loop 标记估算的群体扩张时间分别为11 万年前[33]和（1.7～5.6）万年前[32]，对棘头梅童鱼COI 和D-loop 标记估算的群体扩张时间分别为7 万年前[35]和3.8～12.9 万年前[36]。同时，由于中国沿海鱼类受到更新世冰期和间冰期的影响，同域分布的不同种鱼类群体扩张时间存在较大差异，如褐菖鲉Sebastiscus marmoratus 群体扩张时间为（26.8～44.8）万年前[37]、中国鲳Pampus chinensis 群体扩张时间为（11.7～16.9）万年前[38]以及花斑蛇鲻Saurida undosquamis 群体扩张时间为（4～10）万年前[39]等。但是对于多鳞四指马鲅不同分子标记对群体扩张时间估算的影响以及不同物种间扩张时间的差异，可能是由于物种分布范围很小（仅分布于中国的东海和南海）或者可能是种群扩张的时间过短造成的。

3.3 多鳞四指马鲅的种群遗传结构

由于多鳞四指马鲅游泳能力强且具有迁移洄游习性，东海和南海之间也缺乏明显的地理屏障，即使在更新世冰期，南海也能通过巴士海峡与太平洋相连[40-41]。多鳞四指马鲅的单倍型中间网络连接图、系统发育树以及分子方差分析结果显示，东海和南海群体基因交流频繁，为单一种群结构。虽然基于AFLP 标记和鱼体形态特征的研究发现，中国沿海的多鳞四指马鲅已产生一定程度的分化[9-10]，但是分化程度并不显著。因此，中国沿海的多鳞四指马鲅可作为单一种群进行管理和开发。

4 总结

中国沿海的多鳞四指马鲅具有较高的遗传多样性，为单一种群结构，且可能经历过种群的快速扩张。本研究采样时间和采样批次过于集中，样本数量也偏少，采样群体可能无法代表整个种群状况。这是由于多鳞四指马鲅的捕捞量较为稀少，价格昂贵，且渔汛期十分集中，因此样本十分珍贵。同时，鉴于不同分子标记的研究结果之间存在较大的差异，如遗传多样性和群体扩张时间，可能需要采用分辨率更高的分子标记（如单核苷酸多态性）以及扩大采样的时空跨度，以期更加准确地阐明该物种的种群遗传结构，为该渔业资源管理的开发和利用提供更加科学的基础资料。