高效液相色谱法测定绿茶中咖啡因的含量

曹志龙 杨建

摘要 目的：建立HPLC法快速测定绿茶中的咖啡因。方法：甲醇+水=75+25（v/v）; Waters 2696-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）;流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长280 nm，进样量10μL。结果：浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9997）， 水浴加热提取1.5h最佳。结论：用该方法测定茶叶中的咖啡因，操作简单、快速、准确，结果令人满意。

关键词：咖啡因; HPLC; 茶叶; 含量分析

中国是茶的故乡，制茶、饮茶已有几千年历史，名品荟萃，主要品种有绿茶、红茶、乌龙茶、花茶、白茶、黄茶。茶叶的营养价值和药理作用是与它的化学成分分不开的。它的化学组成约有四百多种，其中对人体营养价值与药理作用关系比较密切的是多酚类、生物碱和维生素[2 ]。茶叶中含一定量的咖啡因，咖啡因又称咖啡碱， 化学名为1， 3， 7- 三甲基黄嘌呤， 溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶剂。它是一种中枢神经兴奋剂。一些人体和动物实验认为咖啡因是一种较弱的致突变和致畸物， 还可引起局部缺血性心脏病， 心律不齐[3]。我国食品添加剂使用卫生标准GB2760- 86 规定，咖啡因的含量是饮料和茶叶中的一个重要品质指标， 其含量测定一直受到分析工作者的关注。本实验对已经提纯的绿茶采用直接稀释处理后，将待测液用高效液相色谱法进行含量测定[4]。

1、仪器与试药

高效液相色谱仪：Waters 2696， UV检测器：Waters 2487，配有自动进样器、在线脱气装置。色谱工作站：Millennium32。绿茶为市售，咖啡因对照品（批号：200808，中国药品生物制品检定所）;甲醇（色谱纯，美国天地公司）;实验用水均为纯净水。

2、方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：C18 （4.6×150）mm，5μm，大连依利特生产，流动相：甲醇︰水=25︰75，测定波长280nm， 柱温：40℃，流速：1ml/min。

2.2 系统适用性试验 取供试品溶液 10μ L进样， 记录色谱图， 咖啡因峰的保留时间为6.730min，各峰与相邻峰的分离度均大于1.5，其后的杂质峰分理论板数按咖啡因峰计算不低于 2000。供试品及对照品的色谱图见图 1。

2.3 溶液制备

对照品储备液：精密称取干燥至恒重的咖啡因对照品5mg于10ml量瓶中，加甲醇定容，制成1ml含咖啡因0.5mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液：装好索氏提取装置，精密称取干燥茶叶粉末5.0g，置于卷好的滤纸套筒中，放入索氏提取器，在圆底烧瓶中加入50ml95%乙醇，水浴（95℃）加热，连续提取约1.5h，抽滤，二次水洗涤滤渣，滤液转入50ml容量瓶中，用二次水定容至刻度。摇匀，即为样品储备溶液。取样品储备液1ml于50ml量瓶中，即得。

2.4方法学考察

2.4.1 线性范围的考察

精密称取咖啡因对照品，配置成浓度为0.5mg/ml的溶液，作为贮备液。分别量取贮备液0.2ml，0.8ml，1.2ml，1.6ml，2.0ml置于10ml容量瓶，稀释至刻度，得到浓度为10μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml系列标准溶液。取上述系列浓度溶液经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样，得系列浓度对应峰面积和保留时间。以标准溶液的质量浓度（X ）为横坐标， 色谱峰面积 （Y ）为纵坐标， 绘制标准曲线， 其线性方程：Y=26661X-62352，相关系数：R=0.9999，表明咖啡因在10-100μg范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

吸取绿茶提取液样品10μL注入液相色谱仪， 重复测定6 次， 峰面积RSD=0.7%。

2.4.3 稳定性试验 吸取同一供试品溶液10μL，分别于0，2，4，6，12，24h进样，测定峰面积RSD=2.4%，表明至少24h内供试品溶液仍保持稳定。

2.4.4 加标回收率试验

精密称量取 9份已知含量的同批样品约2ml ，分别加入延胡索乙素对照品溶液0.2，0.4，0.6 ml各 3份， 按供试品溶液”制备方法制备后， HPLC测定， 记录峰面积，计算回收率，结果见表2。

3 样品测定： 取样品 3批，按照供试品溶液制备方法操作后， HPLC 测定， 结果分别是35.70μg/ ml，35.56μg/ ml，34.96μg/ ml。

4 討论

4.1流动相的选择：本试验采用 HPLC法测定延胡索乙素的含量，采用甲醇- 水（体积比为 25： 75）为流动相，咖啡因的保留时间为6.730min，且分离度和对称性均良好。

4.2提取溶剂的选择：本试验采用75%乙醇、95%乙醇提取，结果表明95%乙醇提取的样品咖啡因含量高。

4.3提取时间的考察： 本试验采用1 h、1.5 h、3 h水浴加热提取，结果表明水浴加热提取1 h咖啡因含量低于1.5 h，而水浴加热提取1.5h、3 h含量无差异，故选择水浴加热提取1.5h。

参考文献：

[1 ]江明性.新编实用药物学[M]. 2版.北京：科学出版社， 2005： 191 - 192 .

[2 ]冯雪松，刘雅茹，王大成，等.支持向量回归 -紫外分光光度法用于测量小儿氨酚匹林咖啡因片含量的方法研究[ J ] .广东药学院学报， 2006，22 （1） ： 43 - 46 .

[3 ]汪必琴，郑亚西.紫外分光光度法测定饮料、 巧克力和茶叶中咖啡因含量的研究[ J ] .四川师范大学学报：自然科学版， 2000， 23 （3） ： 309 - 311 .

[4 ]唐根源，吴红京，吴棱，等.等度反相高效液相色谱法测定茶多酚中的儿茶素和咖啡因[J ].色谱， 2001， 19 （3） ： 233 - 235 .