瘦素对缺血再灌注损伤大鼠脑损伤的保护作用及机制研究*

张 艳，胡诗俊，蓝翊宁，李胜昆，秦 超，程道宾Δ

（1.广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁 530021；2.海南省人民医院，海口 570100）

脑卒中是全球所有年龄段残疾调整生命年的第二大原因，也是中国居民死亡的首要原因[1]。缺血性卒中治疗的关键是在一定时间窗内开通闭塞血管、恢复血流以挽救缺血半暗带组织。然而，再灌注过程会出现氧化应激激增、炎症级联反应和细胞过度凋亡[2]。最近研究报道，脑缺血再灌注损伤的病理生理过程与内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的相关机制有关[3-4]。适度的ERS有助于恢复细胞稳态，但过激或持久的ERS会介导促凋亡蛋白的表达，导致细胞凋亡，从而加重再灌注损伤[5]。

瘦素是一种由脂肪组织分泌的多肽激素，具有抑制食物摄入，调节体重平衡及能量代谢的作用[6]。先前有研究表明，瘦素可与中枢神经系统的受体结合在脑缺血再灌注损伤中发挥抗凋亡作用，并能增加神经元存活及促进血管生成[7-8]。瘦素的神经保护作用涉及多种抗凋亡通路，其中包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路[8]，但其下游机制尚不明确。因此，本研究通过建立脑缺血再灌注损伤的体内模型，旨在观察瘦素的神经保护作用，并探讨瘦素是否通过激活PI3K/Akt信号通路减轻脑缺血—再灌注损伤诱导的ERS，为其在临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和主要仪器 雄性SD 大鼠（260～280 g）由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK 桂2020-0003，动物使用合格证号：SYXK 桂2020-0004。所有实验步骤均遵守中华人民共和国科技部发布的《实验动物福利伦理指南》。

重组大鼠瘦素和原位末端标记（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）试剂盒（罗氏，上海）；PI3K抑制剂LY294002（MCE，上海）；2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液、增强型化学发光试剂（enhanced chemiluminescence，ECL）、含4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-phenylindole，DAPI）抗荧光淬灭封片剂、曲那通溶液、柠檬酸钠抗原修复液、苏木素和伊红（索莱宝，北京）；β-肌动蛋白抗体和过氧化物酶偶联二抗（赛维尔，武汉），ERS相关蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）抗体和半胱氨酸蛋白酶12（Caspase 12）抗体（Abcam，英国）；p-Akt 抗体、Akt 抗体和FITC 标记荧光二抗（CST，美国）；包埋机和手动轮转式切片机（Leica，德国）；多功能荧光发光分析仪（赛默飞，美国）；正置荧光显微镜（OLYMPUS，日本）。

1.2 动物模型制作与分组 将40只大鼠（45只大鼠接受手术，40只存活）随机分为4组：假手术组、模型组、瘦素组和PI3K抑制剂组，每组10只。除假手术组外，其余3 组均采用改良Longa 线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。参考文献[8]的方法，瘦素组术后立即尾静脉注射瘦素（1 mg/kg）；PI3K 抑制剂组在术前30 min 尾静脉注射LY294002（10 μmol/L），术后再经尾静脉注射瘦素（1 mg/kg）。假手术组和模型组术后注射等量生理盐水。

1.3 神经功能缺损评分 参照Longa 氏五分制评分，在再灌注24 h 后对大鼠进行神经功能缺损评分，具体如下：无神经功能缺损为0 分；对侧前爪不能完全伸展为1分；向瘫痪侧转圈为2分；跌向瘫痪侧爬行为3分；无法行走并丧失意识为4分。

1.4 脑梗死体积测定 每组选取4 只大鼠行腹腔麻醉，断头取脑，并将新鲜的脑组织放置-20 ℃冰箱冰冻20 min。取出已冻结的脑组织，去除嗅球，低位脑干和小脑，并以3 mm 间距行冠状位切片。将脑片置于2%TTC 溶液中并在37 ℃条件下避光孵育20 min。为后续观察，将脑片浸入4%多聚甲醛溶液放置4 ℃冰箱固定过夜。使用Image J 软件分析TTC 染色段的图像。通过将梗死面积乘以切片厚度（3 mm）计算梗死体积，梗死体积百分比=梗死体积/全脑体积×100%。

1.5 组织切片标本制备 每组选取3 只大鼠腹腔深麻醉，沿剑突下打开胸腔，从左心室向主动脉弓插管，并剪开右心耳，先用无菌生理盐水冲洗，后换用4%多聚甲醛溶液灌注固定，取脑浸入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常规脱水蜡块包埋后经组织切片机在前囟位置做冠状连续切片，片厚5 μm，脑片与蜡块置于-20 ℃冰箱保存。

1.6 苏木素—伊红（HE）染色观察脑组织病理形态

取备用石蜡切片，经脱蜡、梯度水化后依次用进行HE染色，脱水透明封片，在光学显微镜下观察大脑皮层组织的病理形态。

1.7 TUNEL 染色检测细胞凋亡 脱蜡水化后，切片与0.25%曲那通溶液在室温下孵育20 min。将现配的TUNEL 反应混合物滴加在切片上，37 ℃避光孵育1 h。用含DAPI 的抗荧光衰减封片剂封片后，在荧光显微镜下观察并获取图像。用Image J 软件分析细胞凋亡率，细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞数量×100%。

1.8 蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测p-Akt的蛋白水平 取新鲜右脑组织匀浆，加入适量的细胞裂解液（1 mg∶10 μL）裂解组织，离心后吸取上清液；应用BCA 法检测上清液浓度，加入适量上样缓冲液煮沸10 min；将变性后的蛋白分装放置-80 ℃冰箱保存备用；用10%SDS-PAGE 凝胶进行电泳使蛋白分离，并将蛋白湿转至PVDF 膜；用5%脱脂牛奶溶液室温封闭1 h；PVDF 膜与一抗溶液（Akt，1∶1 000；p-Akt，1∶2 000）在4 ℃冰箱孵育过夜；TBST溶液洗膜3 次后，与过氧化物酶偶联二抗溶液（1∶10 000）于暗室常温孵育1 h。TBST 溶液洗膜3 次后，滴加ECL 化学发光液于暗室曝光显影，结果用Image J软件作定量分析。

1.9 组织免疫荧光检测CHOP 和Caspase 12 的表达

石蜡切片脱蜡水化后，浸入柠檬酸钠溶液中煮沸10 min。抗原修复后，切片依次用0.25%曲那通穿透20 min，5%山羊血清封闭1 h，并与适当稀释的一抗于4 ℃冰箱孵育过夜。次日，PBS 缓冲液浸洗3次后，与FITC标记荧光二抗避光孵育1 h。PBS缓冲液浸洗3次后，用含DAPI的抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察并获取图像。

1.10 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行数据分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分的比较情况 再灌注24 h 后假手术组未观察到神经功能缺损症状；与假手术组比较，模型组神经功能缺损评分增加（P＜0.001）；与模型组比较，瘦素组的神经功能缺损评分降低（P＜0.001）；PI3K抑制剂组的神经功能缺损评分高于瘦素组（P＜0.01），见图1。

图1 各组神经功能缺损评分比较

2.2 各组脑梗死体积比较情况 TTC染色后，红色区域代表正常脑组织，白色区域代表梗死脑组织。假手术组大鼠脑片被染成均匀的红色，其余3 组均出现不同大小的白色梗死灶；与假手术组比较，模型组梗死灶增加（P＜0.001）；与模型组比较，瘦素组的脑梗死区域的体积百分比减小（P＜0.01）；与瘦素组比较，PI3K 抑制剂组的脑梗死体积百分比增加（P＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠脑组织TTC染色图和脑梗死体积比较

2.3 各组脑组织病理学改变比较情况 光学显微镜下可见，假手术组大鼠皮层组织结构完整，神经细胞形态大致正常，排列整齐致密、边界清晰，细胞结构完整，核仁明显且胞膜连续、胞质饱满；模型组大鼠皮层组织结构疏松，神经细胞肿胀呈不规则状，排列紊乱，细胞核固缩、碎裂，胞膜不完整且胞质中见大量空泡；瘦素组大鼠皮层组织损伤较模型组有不同程度的减轻，其他各项病理改变也均有所减轻；PI3K抑制剂组大鼠的组织损伤和各项病理学改变均较瘦素组严重，见图3。

图3 各组大鼠HE染色后皮层组织损伤情况

2.4 各组TUNEL染色比较情况 假手术组TUNEL阳性细胞（绿色荧光）极少；与假手术组比较，模型组的细胞凋亡率增高（P＜0.001）；与模型组比较，细胞凋亡率下降（P＜0.001）；与瘦素组比较，PI3K 抑制剂组的细胞凋亡率升高（P＜0.001），见图4。

图4 各组大鼠皮层组织的TUNEL染色图和细胞凋亡率比较

2.5 各组磷酸化Akt/总Akt（p-Akt/Akt）的表达情况 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中p-Akt的表达增高（P＜0.01）；与模型组比较，瘦素组大鼠脑组织中p-Akt 的蛋白水平增高（P＜0.01）；与瘦素组比较，抑制剂组p-Akt的表达下降（P＜0.01），见图5。2.6 各组CHOP 和Caspase 12 的表达情况 荧光显微镜下，假手术组仅见少量CHOP 和Caspase 12表达；与假手术组比较，模型组大鼠的皮层神经元中CHOP 和Caspase 12 的荧光密度增强；与模型组比较，瘦素组大鼠皮层神经元中CHOP 和Caspase 12 的荧光密度减弱；与瘦素组比较，PI3K 抑制剂组的CHOP和Caspase 12在神经元上的的荧光密度增强，见图6。

图5 各组大鼠脑组织p-Akt/Akt表达比较

图6 各组大鼠皮层组织CHOP和Caspase 12的荧光染色图

3 讨论

本研究通过建立右侧MCAO/R 模型发现瘦素处理可减少大鼠神经功能缺损评分，降低脑梗死体积百分比和神经细胞凋亡率，并改善缺血后脑组织的病理变化，说明瘦素能有效保护大鼠缺血再灌注后的脑组织，改善神经功能，这些结果与先前研究一致[8-10]。尽管瘦素对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用已得到多位学者的证实，但其作用机制尚待探究。

脑缺血再灌注损伤的病理生理过程错综复杂，受多种因素的调节，ERS 是其中的重要机制[3,11-12]。ERS 是指在缺血缺氧的情况下折叠不良的蛋白滞留于内质网腔的状态，其表现包括3 个交互耦联的动态过程：未折叠蛋白反应、ERS 相关性死亡和整合应激反应。早期的未折叠蛋白反应能通过促进蛋白折叠，加强内质网相关蛋白降解和细胞自噬以及抑制新生蛋白以纠正内质网的失衡状态。然而，细胞内环境持续失衡，ERS 相关细胞凋亡则会发生[5]。众所周知，神经元凋亡是缺血性脑卒中损伤的继发性事件的重要原因[13]。CHOP相关的转录因子途径和Caspase 12依赖性途径是ERS诱导细胞凋亡的两种主要途径[14]。因此，本研究通过组织免疫荧光观察ERS标志蛋白CHOP和Caspase 12在神经元上的表达，结果显示MCAO/R 后大鼠脑组织中CHOP 和Caspase 12 的表达增高，这提示ERS 与脑缺血再灌注损伤的发展进程联系密切。ERS 可诱导瘦素抵抗，从而导致肥胖加重，并且有研究证实瘦素自身也与ERS有关[15]。本研究还检测了瘦素处理后CHOP和Caspase 12的表达，并采用TUNEL染色检测脑组织中神经细胞的凋亡率，结果发现瘦素组大鼠的脑组织中CHOP 和Caspase 12 的表达降低，神经细胞凋亡数量减少，这提示瘦素可能通过抑制ERS以及ERS介导的相关细胞凋亡，从而促进神经细胞存活，减轻再灌注后脑组织损伤。

PI3K/Akt 是细胞内重要的信号转导通路之一，对维持细胞平衡和细胞存活至关重要。本研究结果显示，模型组大鼠脑组织中p-Akt 的蛋白水平高于假手术组，说明脑缺血再灌注损伤时PI3K/Akt信号通路被激活。此外，瘦素治疗后p-Akt 的表达水平进一步增高，提示瘦素能激活PI3K/Akt 通路，从而促进神经细胞存活、减轻脑损伤。根据Liu 等[16]报道，ERS 标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78 通过PI3K/Akt 信号转导促进缺血性卒中后内源性神经干细胞的生存和生长，这提示PI3K/Akt信号通路可能与ERS有关。本研究发现PI3K抑制剂预处理后，瘦素的神经保护作用明显减弱，并且与再灌注后单独注射瘦素相比，p-Akt 的表达降低，CHOP 和Caspase 12的表达及神经细胞凋亡率均升高，说明瘦素有可能通过激活PI3K/Akt 信号通路减轻脑缺血再灌注诱导的ERS相关性细胞死亡。

综上，瘦素可有效改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损评分，减少脑梗死体积，降低神经细胞损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt 信号通路，减轻内质网应激有关。