基于TLR4信号通路研究利拉鲁肽对脂多糖诱导的原代小胶质细胞炎症反应的作用机制*

杨泽麟，荣 曦，刘 红

（广西医科大学第一附属医院老年病学内分泌代谢科，南宁 530021）

利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物，主要通过刺激胰岛素分泌和降低胰高血糖素水平来降低血糖水平，临床用于治疗糖尿病[1]。研究发现，利拉鲁肽能够穿越血脑屏障，促进神经元存活、保护神经细胞凋亡、调节神经炎性反应和应激反应，具有很强的抗炎及神经保护作用；并且许多脑内神经元可分泌GLP-1[2]。小胶质细胞是中枢神经系统中一个独特的细胞群，它是一种多功能细胞，它与中枢神经系统中的很多其他细胞相互作用，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。大量研究表明，小胶质细胞不仅在中枢神经系统中扮演监视者和旁观者的角色，更是影响众多疾病的决定因素，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、多发性硬化症（MS）、肥胖症[3-4]。而这些疾病的发生均与炎症反应密不可分，小胶质细胞在神经系统慢性炎症的发生、发展中扮演着重要角色[5]。脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞壁的组成成分，由脂质和多糖构成，可以通过和宿主细胞表面的Toll 样受体4（TLR4）结合发挥作用。当LPS 与TLR4 结合时，其会通过衔接蛋白—髓样分化因子88（MyD88）激活丝氨酸/苏氨酸激酶这种IL-1 受体相关激酶（IRAK）。此外，它还会通过位于IRAK下游的衔接蛋白TRAF6刺激与炎症反应有关的NF-κB和MAP激酶家族等的活化作用，展现其转录活性[6]。本研究旨在通过LPS激活原代小胶质细胞，模拟神经炎症反应状态，探索利拉鲁肽发挥抗炎及神经保护作用的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 DMEM 培养基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；胰蛋白酶（Solarbio）；D-Hanks（Meilunbio）；多聚-L-赖氨酸（Solarbio）；Dnase Ⅰ酶（Solarbio）；LPS（Solarbio）；Liraglutide（MCE）；TAK-242（MCE）；Annexin-V PI 细胞双染凋亡检测试剂盒（Bestbio）；兔抗IL-1β 单克隆抗体（abcam）；兔抗TNF-α单克隆抗体（abcam）；兔抗TLR4多克隆抗体（Bioss）；兔抗MyD88 多克隆抗体（Bioss）；兔抗TRAF6 多克隆抗体（Bioss）；兔抗GAPDH 单克隆抗体（abcam）；共聚焦显微镜（Nikon）。

1.2 原代小胶质细胞培养和提纯 取出生1 d SD大鼠（SPF级），用75%酒精浸泡消毒后断头；剪开颅骨，取出脑组织置于预冷的D-Hanks 液中。剥离脑膜和血管，在冰上充分剪碎脑组织，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴充分消化20 min。用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，加入DnaseI酶去除粘性沉淀，1 000 r/min 离心5 min。弃上清后，用完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶中（培养瓶提前用多聚-L-赖氨酸包被，使用前PBS 冲洗3 遍），在含5%CO2的37 ℃恒温细胞培养箱中培养。培养7～9 d 后，培养瓶中形成混合细胞层，底部为星形胶质细胞，小胶质细胞和少量少突胶质细胞生长在星形胶质细胞的顶端。采用手工拍打法分离小胶质细胞，大力拍打培养瓶5～10 min，在显微镜下观察到混合细胞层的上层细胞大部分脱落，收集上清，1 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀即为小胶质细胞。用含2%胎牛血清的完全培养基重悬细胞，在含5%CO2的37 ℃恒温细胞培养箱中继续培养[7]。

1.3 免疫荧光法鉴定原代小胶质细胞 待细胞完全贴壁，弃除培养基，用PBS溶液洗涤2次；加入4%多聚甲醛室温固定15 min，再洗涤3 次；使用0.25%Triton 破膜，37 ℃保存10 min 后，再洗涤3 次，封闭30 min。加入荧光一抗Iba-1溶液（1∶100），4 ℃孵育过夜；弃除一抗溶液，PBS洗涤3次；加入DAPI原液染核，避光孵育5 min，再洗涤3次；加入抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜下观察结果。用Image J软件定量分析3 个随机视野中Iba-1 标记的细胞占同一视野中细胞总数的百分比，即为小胶质细胞的纯度。

1.4 细胞分组及药物干预 将提纯后的小胶质细胞随机分为5组：空白对照（N）组、LPS组、利拉鲁肽（Li）组、LPS+利拉鲁肽（LL）组及LPS+TLR4抑制剂（LT）组。N 组不做任何处理，LPS 组用100 ng/mL LPS 干预24 h，Li 组用100 nmol/L 利拉鲁肽干预24 h，LL 组用100 ng/mL LPS 干预24 h+100 nmol/L 利拉鲁肽干预24 h，LT组用100 ng/mL LPS干预24 h+100 nmol/L TAK-242干预24 h。

1.5 流式细胞仪测定细胞凋亡率 细胞用PBS 洗涤1次，加入0.25%胰酶消化，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入培养基终止消化。收集于EP 管中，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。加入4 ℃预冷的PBS 完全重悬细胞，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。沉淀用Binding Buffer 重悬。加入Propidium Iodide，混匀，室温下避光反应5～15 min,加入Annexin V-FITC。于1 h内上机检测。

1.6 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测各蛋白的表达量 使用蛋白裂解液（按1∶100 加入PMSF）冰上裂解细胞至少30 min，再次超声裂解细胞后，4 ℃、13 000 r/min离心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，冷却后-80 ℃保存。配置分离胶和浓缩胶，将蛋白样品加入SDS-PAGE 胶，开始电泳。电泳完成后，将蛋白转至PVDF膜。转膜结束后，室温封闭1 h，再用1×TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min。分别与IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6 一抗溶液（1∶1 000）孵育过夜，洗脱一抗后与山羊抗兔二抗溶液（1∶5 000）室温孵育1 h，洗膜5 min×3次。LI-COR Odyssey Infrared Imaging System成像。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件分析实验数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素ANOVA 检验，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小胶质细胞纯度鉴定 免疫荧光法染色的小胶质细胞（图1），小胶质细胞的特异性标记蛋白为Iba-1，为红色染色；DAPI染细胞核，为蓝色染色；合并重叠后细胞有着色。小胶质细胞纯度为（95.59±1.53）%。

图1 免疫荧光染色结果（×200）

2.2 流式细胞仪测定各组细胞总凋亡率 与N 组（11.97±1.31）%比较，LPS 组（30.67±0.12）%细胞总凋亡率升高（P＜0.05）。与LPS 组比较，LL 组（19.58±0.20）%和LT 组（17.51±0.40）%细胞总凋亡率呈下降趋势（P＜0.05），见图2。

图2 流式细胞仪测定各组细胞总凋亡率及结果分析

2.3 各组细胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达情况 与N组比较，LPS组TLR4、MyD88、TRAF6 和炎症因子IL-1β、TNF-α 的蛋白相对表达量均增加（均P＜0.05）。与LPS 组比较，LL 组和LT组TLR4、MyD88、TRAF6、IL-1β、TNF-α蛋白相对表达量均下降（均P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞IL-1β、TNF-α、TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达及结果分析

3 讨论

在缺血性中风、多发性硬化、亨廷顿舞蹈症等疾病中，小胶质细胞被慢性激活，从而放大神经元的死亡[8-9]。另外，高脂饮食会诱导星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元产生促炎因子，从而导致下丘脑炎症，这一机制在诱导肥胖中发挥核心作用[10]。因此，小胶质细胞激活的具体机制可能是预防或治疗这些神经系统疾病和肥胖症的关键[11]。

利拉鲁肽主要通过模拟天然GLP-1 激活体内的GLP-1受体发挥作用。研究发现，利拉鲁肽可以降低小胶质细胞活化数量，从而降低其炎症反应；并通过减少小胶质细胞增生，刺激抗细胞凋亡途径，从而保护神经细胞[12-14]。

IL-1β具有较强的促炎活性，在炎症反应和免疫应答方面发挥重要作用；与它类似，TNF-α可以调节多种发育和免疫过程，如炎症、凋亡、脂质代谢[15]。研究表明，LPS 可以诱导小胶质细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎症因子，进而促进炎症反应发生，造成组织损伤[16]。本研究发现，GLP-1 类似物利拉鲁肽能下调小胶质细胞促炎因子IL-1β、TNF-α蛋白表达，说明利拉鲁肽能减轻小胶质细胞的氧化应激和炎症反应。

TLR4 信号通路被LPS 激活可以触发两个信号级联反应：第一个信号转导途径涉及TIRAP 和MyD88接头蛋白，第二个信号级联反应则结合接头蛋白TRAM 和TRIF[17]。MyD88 是TLR4 信号通路中的关键接头蛋白，在传递上游信号和招募下游分子中具有重要作用[18]。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）是一类多功能的细胞内信号转导因子，TRAF6 能被MyD88 招募，作为一个重要的连接分子调节TLR4 信号通路的转导[19]。本研究发现，利拉鲁肽和TLR4 抑制剂（TAK-242）的干预均能显著降低TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达和细胞总凋亡率，改善细胞损伤状态，提示利拉鲁肽具有TLR4抑制剂类似作用，能显著降低TLR4信号通路活性，下调通路关键因子表达。综上，本课题组认为利拉鲁肽能通过下调TLR4信号通路中关键因子表达抑制LPS 诱导的原代小胶质细胞炎症反应，并改善细胞凋亡，发挥神经保护作用。

本研究以原代小胶质细胞为研究对象，基于TLR4 信号通路，探究了GLP-1 类似物利拉鲁肽在抗炎及神经保护方面的潜在作用机制，为GLP-1类似物应用于神经相关性疾病提供了理论基础。但炎症反应受多种受体信号通路共同支配，是一个复杂多样的过程，本研究仅在细胞培养水平进行基础研究，证据尚不充分。未来本课题组将进一步联合动物实验及临床研究，继续探索GLP-1治疗神经炎症的效果及作用机制。