肝细胞癌差异表达的癌—睾丸抗原筛选及表达初步验证*

李晓莹，刘 畅，李 鑫，薛春红，农蔚霞，葛盈盈，张庆梅，谢小薰，罗 彬Δ，曾麒燕

（广西医科大学 1.基础医学院生物化学与分子生物学教研室；2.基础医学院组织学与胚胎学教研室；3.第一附属医院；4.广西高校生物分子医学研究重点实验室，南宁 530021）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤，占原发性肝癌的75%～85%，是第二大肿瘤致死病因[1]。HCC 恶性程度高，易复发转移且发病隐匿、进展快，多数患者就诊时已属晚期，预后差[2]，因此急需探寻新的治疗方法。癌—睾丸抗原（cancer-testis antigen，CTA）是一类在肿瘤中表达，而在除睾丸以外的正常组织中不表达或低表达的肿瘤相关抗原。因其肿瘤特异性和免疫原性，成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。研究发现，CTA参与肿瘤的发生，可作为肿瘤的早期诊断标记[3]，部分CTA作为肿瘤抗原疫苗，如NY-ESO-1,MAGE-A3等应用于临床治疗已取得一定疗效[4]，这表明CTA在肿瘤诊断和免疫治疗等具有应用前景。目前，大部分CTA在HCC 中的功能还不清楚，因此有必要进一步寻找与HCC 密切相关的CTA。本研究首先通过生物信息学方法，筛选出在HCC中差异表达且与预后相关的CTA，然后分析它们在HCC 中的功能，并初步验证这些CTA在HCC中的表达情况，旨在为后续深入研究HCC免疫靶向治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集广西医科大学第一附属医院肝胆外科手术患者32 例[男28 例，女4 例；年龄32～65 岁，平均（44.5±9.2）岁]HCC 组织及其中10 例配对的癌旁组织，组织离体后取材置于液氮保存。Edmondson-Steinner 法病理分级：Ⅰ级0 例，Ⅱ级22 例，Ⅲ级9，Ⅳ级1 例。TNM 分期：Ⅰ期0 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期2例，Ⅳ期20例。同时，收集所有患者的临床相关资料。标本收集经患者知情同意和广西医科大学伦理委员会批准（伦理编号：20220145）。

1.2 生物信息学分析

1.2.1 基因表达分析 利用GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）在线分析CT抗原数据库（http://www.cta.lncc.br/）中258 个CTA在HCC 中的表达情况，Log2（Fold Change）＞0、P＜0.05被认为是表达上调基因，Log2（Fold Change）＜0、P＜0.05被认为是表达下调基因，并以Log2（Fold Change）＞1，P＜0.05为标准，获取HCC 中显著差异表达CTA，结果以R语言绘制火山图可视化。

1.2.2 生存分析 采用Linkedomics 数据库（http://www.linkedomics.org/login.php）对显著差异表达CTA进行Cox Regression生存分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，获取与HCC预后相关的CTA。

1.2.3CTA基因功能分析 采用Linkedomics 数据库以相关系数r＞0.3 为标准获取HCC 中显著差异表达且与预后相关的CTA共表达基因，用DAVID在线工具（https：//david.ncifcrf.gov）对CTA共表达基因进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，预测CTA在HCC 中的功能，以P＜0.05 为差异有统计学意义，结果以R语言绘制柱状图和气泡图可视化。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测HCC 中NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表达

采用RNA 提取试剂盒（南京诺唯赞公司，#RC101-01）提取组织总RNA。用cDNA 逆转录试剂盒（南京诺唯赞公司，#R323-0-1），将总RNA逆转录成相应cDNA。SYBR Green 染料法行qPCR（南京诺唯赞公司，#Q711-02）检测，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共计40 个循环反应。所用引物由生工生物（上海）股份有限公司合成，见表1。

表1 qPCR扩增引物序列

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用Fisher 确切概率法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC中差异表达的CTA基因筛选

通过GEPIA 数据库查找258 个CTA基因在HCC中的表达情况，发现63个CTA表达上调，15个CTA表达下调（图1）；筛选表达上调、排名靠前的8个CTA，即NUF2、PBK、ATAD2、KIF2C、OIP5、SPAG4、CASC5和SPA17，这些CTA在癌组织中的表达均高于正常组织（P＜0.05）（图2）。

图1 GEPIA数据库分析258个CTA在HCC中的表达

图2 GEPIA数据库分析8个CTA在HCC和正常肝组织中的表达

2.2 差异表达CTA与HCC患者预后的关系

为进一步评估显著差异CTA与HCC 预后的关系，使用Linkedomics数据库对上述8个CTA进行生存分析（图3），发现NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17等5 个CTA均与HCC 患者的临床预后相关（P＜0.05），CTA 高表达者的总生存期低于低表达者。

图3 Linkedomics数据库分析5个CTA在HCC中的生存曲线

2.3 HCC 中NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表达分析

qRT-PCR 结果显示，HCC 中NUF2和PBKmRNA的表达高于癌旁组织（P＜0.05），见图4。

图4 RT-qPCR检测NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17 mRNA在HCC和癌旁组织中的表达

2.4 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17功能预测

GO和KEGG富集分析结果：与NUF2表达正相关的基因1 907个；与PBK表达正相关的基因1 486个；与KIF2C表达正相关的基因2 242个；与OIP5表达正相关的基因1 582 个；与SPA17 表达正相关基因230 个，主要参与转录及其调控、细胞分裂、纤毛形态发生等生物学过程，涉及细胞周期、剪接体及RNA运输、轴突导向等信号通路，见图5。

图5 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5和SPA17的GO和KEGG分析

2.5 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17与HCC临床参数的关系

以癌组织CTAmRNA 表达中位数为界分为高表达组和低表达组（高于中位数为高表达组，否则为低表达组），分析CTA表达水平与HCC患者性别、年龄、HBV 感染、肿瘤大小、血清甲胎蛋白（AFP）、肝硬化、WHO 分级、TNM 分期等临床参数的关系，结果表明均无相关性（P＞0.05），见表2。

表2 NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17 mRNA的表达与HCC患者临床参数的关系

3 讨论

HCC是广西高发性疾病，近年发病率和病死率呈逐年上升趋势[5]，因此急需新的辅助疗法，肿瘤免疫治疗因有较好的特异性和较小的副作用而成为研究热点。近年来，CTA日益受到关注。本研究运用生物信息学的方法，筛选出HCC中显著差异表达且与预后相关的5 个CTA：NUF2、PBK、KIF2C、OIP5、SPA17；进一步对这5 个CTA进行功能预测，随后进行CTA表达的初步验证，并探讨CTA水平与HCC临床参数的关系。

NUF2（NDC80 kinetochore complex component）也称为CT106，作为细胞分裂周期相关蛋白家族，主要参与动粒—微管黏附、细胞有丝分裂等过程，其异常表达与肿瘤的发生密切相关[6]。研究发现，NUF2的缺失可诱导肝癌细胞周期阻滞引发细胞凋亡，并明显抑制HCC 生长[7]。Liu 等[8]报道，NUF2在HCC中高表达，可作为HCC不良预后的标志物。本研究也表明NUF2在HCC组织中高表达，生物信息学分析显示NUF2与HCC预后相关，推测其可能通过调控细胞周期促进HCC的发生发展。

PBK（PDZ-binding kinase）也称为CT84，是MAPKK 家族成员，能与cdk1/cyclin、P53、NF-κB 等相互作用，调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等[9]。Yang 等[10]报道，上调PBK表达能通过ETV4-uPAR信号通路促进肝癌细胞侵袭和转移。另一研究表明，HCC中PBK高表达与肿瘤大小、血管浸润、淋巴结转移有关，下调PBK表达能抑制HCC 的生长和转移[11]。本研究也发现PBK在HCC中高表达；PBK与临床病理参数无关，可能与样本量例数较少有关。

KIF2C（kinesin family member 2C）也称为CT139，主要参与微管解聚、微丝与着丝粒位点结合及染色体分离，从而调控细胞的有丝分裂进程，与肿瘤的进展密切相关[12]。OIP5（Opa interacting protein 5）又称CT86，主要参与调控细胞的有丝分裂过程,对维持着丝粒的结构和功能起着重要作用[13]。SPA17（sperm autoantigenic protein 17），在CTA家族中又名CT22，是一种透明带相互作用蛋白，主要存在于精子尾部的纤维鞘中，参与精子成熟和受精过程[14]。研究发现KIF2C、OIP5和SPA17均高表达于HCC，其中KIF2C和OIP5与HCC 的恶性程度呈正相关关系，SPA17与HCC 的分化有关，且KIF2C和OIP5与HCC 不良预后相关[15-17]。本研究通过RTqPCR检测发现KIF2C、OIP5、SPA17在HCC与癌旁组织中表达无显著差异，可能与样本数较少和组织异质性等因素有关。

本研究经过生物信息学筛选并初步分析了HCC 中高表达的CTA，并通过实验验证NUF2和PBK在HCC 组织中的表达高于癌旁组织，这提示NUF2和PBK有望成为HCC 潜在治疗靶点。本实验尚存在一些不足之处，如病例样本量较小等，后期需进一步扩大临床样本量，并结合HCC患者预后进行分析，深入探讨其分子机制，以期为HCC 的诊疗提供新的思路。