加味消毒饮颗粒质量标准研究*

张 浩，罗朝亮，韦开听，吴无畏，周贤强，蒋伟哲,△，陈 路

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021；2.广西壮族自治区药用植物园，南宁 530023；3.广西壮要方医院，南宁 530150）

五味消毒饮方出自清代吴谦编纂的《医宗金鉴》，处方由金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等五味药材组成[1]，作为传统中药方剂在我国已有数百年的应用历史，具有清热解毒，散结消肿之功效。广西壮要方医院由宜州民族医药研究所团队创建而成，在长期的临床医疗实践中，根据风热感冒[2]、咽炎[3]、扁桃体炎[4]、痤疮[5]等疾病的特点，对五味消毒饮方进行了调整，删减了紫花地丁和天葵子，增加了清热解毒功效更佳的黄芩、穿心莲和栀子药材，形成了由黄芩、山银花、穿心莲、野菊花、蒲公英和栀子这6味药材组成的“加味消毒饮颗粒”方药。由于之前一直以处方药的形式使用，患者用药不方便，广西壮要方医院则运用现代制药技术，将该方进行了开发和研制。为了控制加味消毒饮颗粒质量，确保临床用药的有效性，本文以建立加味消毒饮颗粒剂的质量标准为目的，通过薄层色谱（TLC）法定性鉴别该制剂中的黄芩、野菊花和栀子等药材，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中黄芩苷的含量，以期为该制剂建立质量标准。

1 材料与方法

1.1 仪器

VARIAN 210 高效液相色谱仪（美国瓦里安）；BSA124S 型万分之一电子分析天平（Sartorius 公司）；UV-1240 型紫外可见光光度计（Shimadzu 公司）；SB-5200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ZF-8型暗箱式四用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）。

1.2 试药

黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821，含量以95.4%计）；黄芩素、汉黄芩素、蒙花苷、栀子苷、黄芩对照药材、野菊花对照药材、栀子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：111595-201808、111514-201706、111528-201710、110749-201919、120995-201810、120995-201707、120986-201610）；加味消毒饮颗粒（广西壮族自治区药用植物园国家工程实验室制备，规格：10 g/袋，批号：20200401、20200402、2020403）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 TLC鉴别

1.3.1 黄芩的鉴别方法 取本品5 g，研细，加水30 mL，超声处理5 min，用乙酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为供试品溶液；另取黄芩素和汉黄芩素对照品，加甲醇制成每1 mL 含黄芩素和汉黄芩素各1.0mg 的混合溶液，作为对照品溶液；再取黄芩对照药材1 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL 溶解，作为黄芩对照药材溶液；根据处方取缺黄芩的其他组方药材，按制备工艺制成颗粒，同法制成阴性样品溶液。照TLC法（通则0502）试验，吸取上述4种溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（10∶2∶1∶2）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此斑点。

1.3.2 野菊花的鉴别 取本品3 g，研细，加水30 mL，超声处理30 min，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；另取蒙花苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.2mg 的溶液，作为对照品溶液；再取野菊花对照药材粉末0.3g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液作为对照药材溶液；根据处方取缺野菊花的其他组方药材，按制备工艺制成颗粒，同法制成阴性样品溶液。照TLC法（通则0502）试验，吸取上述4种溶液各3 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯∶丁酮∶三氯甲烷∶甲酸∶水（15∶15∶8∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝溶液，热风吹干，置紫外灯光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此斑点。

1.3.3 栀子的鉴别 取本品3 g，研细，加入50%甲醇10 mL，超声处理40 min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取栀子对照药材1 g，加入50%甲醇10 mL，超声处理40 min，过滤，滤液作为对照药材溶液；再取栀子苷对照品，加乙醇制成每1 mL 含4 mg 的溶液，作为对照品溶液；根据处方取缺栀子的其他组方药材，按制备工艺制成颗粒，同法制成阴性样品溶液。照TLC法（通则0502）试验，吸取上述 4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 板薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水∶甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）为展开剂，展开，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无此斑点。

1.4 黄芩苷含量测定

1.4.1 色谱条件与系统适用性试验 根据参考文献方法[6-8]以及多次试验，确定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶磷酸（48∶52∶0.1）为流动相；检测波长为330 nm；流速为1.0mL/min；柱温为30°C；进样量为10 μL；理论塔板数按黄芩苷峰计应不低于5 000。

1.4.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品0.0255 g（含量以95.4%计）置100 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，摇匀，作为对照品储备液（浓度0.2433 mg/mL）。再精密量取对照品储备液5 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，得浓度为0.1217 mg/mL的黄芩苷对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品（批号：20200401），混匀，取适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.4 阴性样品溶液的制备 精密称取缺黄芩的阴性颗粒1 g，按供试品溶液制备方法操作，得阴性样品溶液。

1.4.5 方法学考察

1.4.5.1 专属性考察 按“1.4.1 项”色谱条件，分别精密吸取上述黄芩苷对照品溶液、供试品溶液、黄芩阴性供试品溶液各10 μL 分次注入HPLC 仪中，记录图谱。

1.4.5.2 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液（浓度0.2433 mg/mL）1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，分别置于不同的10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度后，过滤，按色谱条件测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标绘制成标准曲线，计算线性方程。

1.4.5.3 精密度试验 取配制好的黄芩苷对照品溶液（浓度0.1217 mg/mL），按“1.4.1项”色谱条件在色谱仪中连续重复进样6次进行测定，记录色谱图，考察黄芩苷对照品峰面积的变化情况。

1.4.5.4 稳定性试验 精密称取同一批号的加味消毒饮颗粒（批号：2020401）1 g，按“1.4.3项”下供试品溶液制方法制备加味消毒饮颗粒供试品溶液，分别于配制后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入HPLC仪中进行测定，记录色谱峰面积，考察加味消毒饮颗粒供试品溶液在放置后峰面积的变化情况。

1.4.5.5 重复性试验 精密称取同一批号的加味消毒饮颗粒（批号：20200401）各6份，按“1.4.3项”下供试品溶液制方法制备加味消毒饮颗粒供试品溶液，按色谱条件进行含量测定，计算其结果。

1.4.5.6 加样回收率试验 精密称取黄芩苷对照品，加50%甲醇制成浓度为0.3749 mg/mL的对照品溶液；精密称取9份加味消毒饮颗粒（批号：20200401，黄芩苷含量为5.0108 mg/g）0.5g，依次精密加入浓度为0.3749 mg/mL 的对照溶液适量，各3 份，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇至50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，按色谱条件测定黄芩苷含量，计算其平均加样回收率。

1.5 样品含量测定

分别取不同批号的加味消毒饮颗粒3 批样品，依法制备供试品溶液，并进行测定，计算黄芩苷的含量。

2 结果

2.1 黄芩的鉴别结果

黄芩的鉴别结果见图1，加味消毒饮颗粒供试品色谱分离良好，斑点较清晰，在与黄芩素和汉黄芩素对照品色谱和黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同的灰褐色斑点，其Rf 值适中，分别为0.4和0.64；阴性对照色谱无对应颜色斑点，说明本方法专属性强。

图1 黄芩TLC图

2.2 野菊花的鉴别结果

野菊花的鉴别结果见图2，加味消毒饮颗粒供试品色谱分离较好，斑点较清晰，在与蒙花苷对照品色谱和野菊花对照药材色谱相应的位置上，显相同的青绿色荧光斑点，其Rf 值为0.58；阴性对照色谱无对应颜色斑点。

图2 野菊花TCC图

2.3 栀子的鉴别结果

栀子的鉴别结果见图3，加味消毒饮颗粒供试品色谱分离良好，斑点清晰，在与栀子苷对照品色谱和栀子对照药材色谱相应的位置上，显相同的褐色斑点，其Rf 值为0.52；阴性对照色谱无对应颜色斑点，证明本方法专属性强。

图3 栀子TLC图

2.4 黄芩苷含量测定结果

专属性考察结果中黄芩苷色谱峰分离效果良好，峰形佳，且阴性样品溶液在相同保留时间处未见干扰（图4）。在方法学考察中，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程式Y=33.604X+2.280，r=0.9998（n=8），结果表明进样量在0.243～1.946μg之间，进样量与峰面积之间有良好线性关系。精密度实验测得黄芩苷峰面积的RSD值为0.79%（n=6），表明该含量测定方法的精密度良好。稳定性实验中黄芩苷峰面积的RSD 值为1.63%，证明该颗粒供试品溶液在24 h 内稳定。重复性实验测得黄芩苷含量为5.0108 mg/g，其RSD值为1.82%，表明该含量测定方法的重复性良好。加样回收实验中，平均加样回收率为97.30%，RSD为1.78%，表明此含量测定方法的加样回收率符合要求（表1）。3批加味消毒饮颗粒，其黄芩苷含量分别为5.0108 mg/g，5.1282 mg/g，5.0474 mg/g。

表1 黄芩苷的加样回收结果表

图4 HPLC图

3 讨论

加味消毒饮颗粒含多味中药，成分较复杂。笔者曾对组方中的6 味药材全部进行TLC 鉴别研究，以求更全面地对加味消毒饮颗粒的质量进行控制，但是由于方中山银花、穿心莲和蒲公英药材的层析效果皆不佳，存在组方成分相互干扰的问题，且经反复试验后仍未达到TLC鉴别的要求，故不列入加味消毒饮颗粒的质量标准中。

对于组方中黄芩、野菊花和栀子药材的鉴别，笔者是在前人TLC鉴别方法研究的基础上，进行了适当调整和创新，且经方法学考察证明，均能适合本颗粒剂的鉴别，可以作为评价加味消毒饮颗粒质量的重要手段之一。在研究黄芩的TLC鉴别时，曾参考文献[9]以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸（10∶3∶1∶2）溶液为展开剂，但斑点分离不明显，经过实验调整，比例为10∶2∶1∶2时结果斑点分离效果较好。在研究野菊花的TLC时，曾参考2020年版《中国药典》中野菊花药材的鉴别方法，先以乙酸乙酯∶丁酮∶三氯甲烷∶甲酸∶水（15∶15∶6∶4∶1）作为展开剂，但展开时斑点稍有堆积，不清晰；后将其比例调整为（15∶15∶8∶4∶1），则斑点分离效果较好。在研究栀子的TLC 鉴别中，参考了文献[10]以醋酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水（5∶5∶0.5∶0.5）为展开剂展开，发现斑点不清晰；经过实验发现，以氯仿∶甲醇∶水∶甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）为展开剂，结果斑点清晰。

黄芩是与本制剂作用功效密切相关的君药，而黄芩苷作为黄芩主要的活性成分之一，具有显著的抗炎、抑菌和抗病毒等药理作用[11]。本实验以HPLC 法测定加味消毒饮颗粒剂中黄芩苷的含量，对于本颗粒剂的生产、检验、使用和确保疗效等方面具有重要意义。经参考相关文献[12]和多次试验，发现在以甲醇∶水∶磷酸（48∶52∶0.1）时峰型最好，峰面积合适，且与杂峰分离效果较好，均达到要求。本实验测得到样品溶液中的黄芩苷保留时间合适，且与前后杂质峰的分离度均大于4，峰型和分离度均良好，符合《中国药典》规定。

本实验对加味消毒饮颗粒中黄芩、野菊花和栀子药材进行TLC 鉴别，斑点清晰，供试品溶液与对照品溶液的斑点对应良好，阴性对照无干扰；以HPLC 法测定黄芩苷的含量，分离效果好，峰形良好，保留时间适宜，专属性强，测定结果准确，在规定时间内测定方法稳定。本研究中所建立的方法可靠、准确，操作简单，可确保产品的质量和疗效，保证用药安全。