苯甲酰乌头原碱对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞凋亡、炎症因子的影响

邵鑫 蒋先虹 王瑞

【摘 要】目的：探究苯甲酰乌头原碱（BAC）对类风湿关节炎（RA）患者外周血单个核细胞（PBMC）凋亡、炎症因子的影响及具体凋亡机制，为RA的临床治疗提供参考。方法：募集24例高度活动期RA患者（DAS28评分 > 5.1分），同期纳入性别、年龄匹配的16例健康体检者为正常对照组（HC组）。采用梯度离心法分离PBMC;分别检测加药前及最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1 BAC干预RA组、HC组PBMC细胞24 h后，实时荧光定量PCR与Western blot法检测细胞中凋亡相关基因及蛋白的表达

水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率;酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养液中炎症因子白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果：RA组PBMC细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白相對表达量增加，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量减少，与HC组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。加入BAC干预后，150，300 μmol·L-1 BAC加药组PBMC凋亡率增加，与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。150，300 μmol·L-1 BAC加药组PBMC中Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量明显降低，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量明显增加，与0 μmol·L-1 BAC组比较，除150 μmol·L-1 BAC组Bax mRNA和蛋白表达外，其余差异均有统计学意义（P < 0.05）。同时BAC可以降低PBMC培养液中的炎症因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平，

300 μmol·L-1 BAC组最为显著，与0 μmol·L-1 BAC组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：RA患者血清中炎症因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平升高，PBMC凋亡减少，BAC可能通过Bcl-2/Bax、

Caspase-3途径诱导PBMC细胞凋亡，并能降低PBMC中炎症因子水平。

【关键词】 类风湿关节炎;苯甲酰乌头原碱;外周血单个核细胞;凋亡;炎症因子

Effects of Benzoyl Aconitine on Apoptosis of Peripheral Blood Mononuclear Cells and Inflammatory Factors in Patients with Rheumatoid Arthritis

SHAO Xin，JIANG Xian-hong，WANG Rui

【ABSTRACT】Objective：To explore the effects of benzoyl aconitine（BAC）on apoptosis of peripheral blood mononuclear cells（PBMC）and inflammatory factors in patients with rheumatoid arthritis（RA）and the specific apoptosis mechanism，so as to provide reference for the clinical treatment of RA.Methods：Twenty patients with highly active RA（DAS28 score > 5.1）were collected，and 16 healthy physical examiners matched by gender and age were included in the same period as the normal control group（HC group）.PBMC was separated by gradient centrifugation.PBMC cells in the RA group and HC group were detected before medication and till the final mass concentrations being 0 μmol·L-1，150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1.Twenty-four hours later，the expression levels of apoptosis related genes and proteins were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the inflammatory factors IL-1，IL-6，

IL-17 and tumor necrosis factor（TNF-α）in cell culture medium.Results：The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein in PBMC cells of the RA group increased，while the relative expressions of Bax，Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA and protein decreased.Compared with the HC group，the difference was statistically significant（P < 0.05）.After BAC intervention，the apoptosis rate of PBMC with mass concentrations of

150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1 increased，and the difference was statistically significant compared with the control group（P < 0.05）.The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein in PBMC with mass concentrations of 150 μmol·L-1 and 300 μmol·L-1 were significantly reduced，and the relative expressions of Bax，Caspase-3/Cleared Caspase-3 mRNA and protein were significantly increased.Compared with the BAC group with mass concentration of 0 μmol·L-1，except for the expression of Bax mRNA and protein in the BAC group with mass concentration of 150 μmol·L-1，the other differences were statistically significant（P < 0.05）.At the same time，BAC can reduce the levels of inflammatory factors IL-1，IL-6，IL-17 and TNF-α in PBMC culture medium，especially in BAC group with mass concentration of 300 μmol·L-1.Compared with the BAC group with mass concentration of 0 μmol·L-1，the difference was statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：The levels of inflammatory factors IL-1，IL-6，IL-17 and TNF-α in serum of RA patients increase，while apoptosis decreases.BAC may induce PBMC apoptosis through Bcl-2/Bax and Caspase-3 pathways and reduce the level of inflammatory factors in PBMC.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;benzoyl aconitine;peripheral blood mononuclear cells;apoptosis;

inflammatory factors

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种

以滑膜炎为主要特点的自身免疫性疾病，发病机制复杂[1]，其病理损伤主要涉及滑膜成纤维细胞、T淋巴细胞、单个核细胞、巨噬细胞等[2-3]，与细胞增殖、凋亡蛋白的表达异常密切相关[4]。RA中最明显的病理改变发生在关节滑膜中，RA滑膜成纤维细胞凋亡及自噬异常可导致滑膜组织增生肥厚，并且出现新生血管，形成血管翳[5]，是临床上导致RA反复发作和预后不良的主要原因[6]。近年来有研究表明，血液循环中的T淋巴细胞等存在着免疫异常[7]，RA患者外周血中细胞凋亡出现异常[8]。乌头类生物碱是一种具有多种免疫调节作用的中药制剂[9]，主要成分为乌头碱双酯型生物碱和苯甲酰类单酯型生物碱，乌头碱毒性强，治疗范围窄[10]，而苯甲酰乌头原碱（BAC）为单酯型生物碱，毒性大大降低，仍保持一定的药理活性[11]，但其是否可以诱导外周血单个核细胞（PBMC）凋亡和降低炎症因子水平需要进一步研究。关节滑膜组织可通过关节置换手术留取，但由于取材的有创性且手术患者例数较少，使得临床研究具有一定的限制性。目前关于RA患者PBMC凋亡蛋白的表达水平及相关药物性研究数据尚少，为此本研究留取标本较为方便的外周血作为首选，检测高度活动期RA患者PBMC中凋亡相关基因及蛋白的表达，并探索BAC是否能有效诱导其凋亡，为RA的临床诊治和新药开发寻找新的靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 根据美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2010年RA分类标准计算患者得分，选取2018年10月至2019年5月在川北医学院附属医院风湿免疫科住院治疗的高度活动期（DAS28评分 > 5.1分）RA患者24例为RA组，男6例，女18例，平均年龄（45.72±11.73）岁，红细胞沉降率（71.05±15.27）mm·h-1，C反应蛋白（65.64±23.40）mg·L-1，类风湿因子（70.23±47.91）IU·mL-1。另选取同时期年龄、性别匹配的健康体检者16例作为健康对照组（HC组），男4例，女12例，平均年龄（40.51±14.95）岁。

1.2 试剂与仪器 BAC对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-17102610，纯度98.9%）;1640培养基（美国Hyclone公司）;胎牛血清（美国Gibco公司）;兔抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体、兔抗人Caspase-3单克隆抗体、兔抗人Active Caspase-3单克隆抗体（杭州华安生物科技有限公司，批号分别为ET1702-53、ET1701-64、ET1602-47）、鼠抗人β-actin单克隆抗体（成都Zen Bioscience公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（成都Zen Bioscience公司，批号511203、511103）;ECL化学发光液（合肥市Biosharp生物公司）;人淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque（天津灏洋生物制品科技有限公司）;引物（生工生物工程上海股份有限公司）;Trizol试剂（北京索莱宝科技有限公司）;Transcription Kit QuantiNova逆转录试剂盒（德国QIAGEN公司）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Fisher公司）;RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）;BL-150型电子天平（德国Sartorius公司）;LightCycler96 实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）;Pultton P200 + 型超微量紫外分光光度计（北京五洲东方科技發展有限公司）;凝胶成像系统（法国Vilber Lourmat公司）;脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 PBMC的提取 分别取2组受试者3 mL静脉血，置于经抗凝剂肝素处理过的真空采血管中。应用淋巴细胞分离液采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。具体操作步骤为：将3 mL静脉血室温下水平离心机以3000 r·min-1离心5 min，离心半径15 cm，弃上层血清，在只剩血细胞的真空采集管中加入等体积的磷酸盐缓冲液稀释，吹打混匀。取另一离心管加入3 mL淋巴细胞分离液，混匀后缓慢叠加于淋巴细胞分离液表面，转移过程中始终保持界面清晰，避免混合，室温下离心机以2000 r·min-1离心20 min，离心半径30 cm，离心后管内液体分为4层，PBMC所在细胞层为白色，将该层细胞吸取在另一干净的15 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液至10～15 mL，1500 r·min-1离心20 min，离心半径30 cm，离心后去掉上清，清洗后的PBMC使用胎牛血清和1640培养基体外培养。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测PBMC凋亡相关基因的表达水平 将上述分离得到的PBMC按1.5×105个·mL-1接种于12孔板中，每孔2 mL，然后分别加入最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1的BAC于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h（本实验浓度由预实验得出，下同），检测加药前与加入最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1的BAC后细胞凋亡相关基因的表达水平。TRIzol提取细胞总RNA，按反转录试剂盒Transcription Kit QuantiNova说明操作，反转录合成cDNA，采用LightCycler96实时荧光定量PCR仪扩增，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以β-actin为内参照基因，采用2-ΔΔCt法计算各目标基因mRNA的表达水平。引物序列见表1。

1.3.3 Western blot法检测PBMC凋亡相关蛋白的表达水平 将上述分离得到的PBMC按1.5×105个·mL-1接种于12孔板中，每孔2 mL，然后分别加入最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1的BAC于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。分别检测加药前与加入最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1的BAC后细胞凋亡相关蛋白的表达水平。RIPA裂解液提取细胞总蛋白，湿法电泳转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（稀释度均为1∶1000）4 ℃孵育過夜，次日复温后加入二抗（1∶10 000）1 h，用ECL化学发光液显色、定影。用凝胶成像系统采集图像，β-actin作为内参照，以目的蛋白与β-actin吸光度的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.3.4 流式细胞术检测BAC对PBMC凋亡的影响 用完全培养基调整上述分离得到的PBMC密度至1.5×105个·mL-1，接种1 mL于24孔板中，然后分别加入最终质量浓度为0，150，300 μmol·L-1的BAC，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。

收集细胞用PBS洗涤后，加入标记荧光素AnnexinV-FITC、PI染色试剂各5 μL，混匀，室温避光反应5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5 酶联免疫吸附法检测BAC对炎症因子的影响 分别取上述3组细胞的培养液，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-17、TNF-α的含量，按照试剂盒说明操作。实验重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RA组与HC组血清中炎症因子水平比较 成功分离血清后，采用ELISA检测炎症因子，RA组与HC组IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 RA组与HC组PBMC中凋亡相关基因及蛋白表达水平比较 实时定量PCR和Western blot法结果显示，与HC组比较，RA组PBMC中Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量增加，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3、表4。

2.3 BAC促进PBMC凋亡情况 流式细胞仪检测结果显示，150，300 μmol·L-1 BAC加药组PBMC凋亡率分别为（11.47±1.84）%、（21.05±3.56）%，与0 μmol·L-1 BAC（6.56±0.91）%比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且具有浓度依赖性。

2.4 BAC对PBMC凋亡相关基因及蛋白的影响 实时定量PCR和Western blot法结果显示，与0 μmol·L-1 BAC加药组比较，150，300 μmol·L-1 BAC加药组PBMC细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量明显降低，Bax、Caspase-3/Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5、表6。

2.5 BAC对PBMC培养液中炎症因子表达的影响 经0，150，300 μmol·L-1 BAC干预后，150，300 μmol·L-1 BAC加药组细胞培养液中炎症因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α含量均有所降低，与0 μmol·L-1 BAC加药组比较，300 μmol·L-1 BAC加药组降低更为明显，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表7。

3 讨 论

RA的发病机制至今尚不明确，其特点是慢性反复发作，患者大多有炎症反应。有学者发现RA患者细胞中IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌增多，这与本研究结果一致。炎症因子会促使破骨细胞的活化及增殖，进一步加剧病灶的形成，因而，治疗RA的关键之一是控制炎症，使临床症状得到缓解[12-13]。RA患者滑膜细胞过度增殖引起滑膜组织异常增生也是导致关节破坏的主要原因，近年来，阐明RA滑膜细胞的生物学特性及机制研究逐渐深入也愈加明确[14-15]。细胞凋亡是一种受内在基因调控的细胞主动程序化死亡过程，是控制细胞生长的主要途径，线粒体功能障碍被认为是发生凋亡异常的中心环节[16]。Bcl-2是抗细胞凋亡基因，主要分布在线粒体外膜表面，可通过介导细胞膜的通透性抑制促凋亡蛋白的释放，从而阻止细胞凋亡的级联反应[17-18]。本研究通过检测RA组与HC组中PBMC凋亡相关基因与蛋白的表达水平发现，RA组中Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量增加，而Bax mRNA和蛋白相对表达量减少。Caspase级联反应是细胞凋亡通路的中心环节，Caspase-3是Caspase级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶，在死亡受体途径与线粒体凋亡途径等中介导了细胞凋亡[19]。本研究发现，RA组与HC组PBMC中Active Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量也明显减少，上述结果表明，RA患者中PBMC凋亡受到抑制，可能与启动Bax/Bcl-2、Caspase-3线粒体凋亡途径有关。

由于乌头类生物碱表现出治疗RA较好的效果，但因毒性强临床应用受到限制[20]，为此本研究采用毒性大大减弱的BAC作为药物，流式细胞仪检测发现，BAC可以呈浓度依赖性方式促进PBMC凋亡。接着笔者采用RT-qPCR与Western blot法观察了150，300 μmol·L-1的BAC在诱导PBMC细胞凋亡后，凋亡相关基因和蛋白的变化。结果表明，药物作用后，Bcl-2 mRNA与蛋白表达上调，Bax mRNA与蛋白表达下调，Active Caspase-3 mRNA与蛋白表达也显著下调，且与药物的作用浓度相关。此外，BAC可有效降低PBMC培养上清液中的炎症因子IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α水平，并以高剂量组最为明显。以上结果均提示BAC可诱导RA患者中PBMC凋亡，并可降低炎症因子表达，对于RA疾病的机制研究具有重要意义。

目前，RA的发病机制尚未完全明确，研究凋亡相关基因及蛋白在RA患者PBMC中的表达水平变化，深入分析细胞凋亡的调控情况，进一步探讨中药单体有效成分诱导PBMC的凋亡机制，为阐明RA新的发病机制，及其临床诊治提供新的思路具有重要意义。

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收稿日期：2022-05-07;修回日期：2022-06-18