胎羊体外循环术后心脏和胎盘的代谢组学变化

吴文涛，滕 云，田 苗，黄冰鑫，李慧丽，谭剑锋，李晓红，周成斌

复杂先天性心脏病是我国新生儿和婴幼儿死亡的主要原因之一。一些复杂先天性心脏病是由相对简单的原发病变发展而来，若能在胎儿期进行手术干预，则可阻止其向复杂畸形转变，心脏也能在宫内得到再次发育的机会。实施胎儿心脏手术需要安全可靠的体外循环（extracorporeal circulation，ECC）技术，既往动物研究也已证实胎儿ECC的可行性［1-3］。然而，胎儿ECC术后胎盘功能障碍［2］和心功能不全［3］仍是实验性胎儿心脏手术的致命缺陷。近年来，随着组学技术的迅速发展，代谢组学已被用于研究ECC术后缺血再灌注损伤［4］、急性肾损伤［5］和脑缺血保护［6］。本研究构建胎羊ECC模型，并对转流后胎羊的心脏和胎盘组织进行基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的非靶代谢组学测序，目标是阐明胎羊ECC后心脏和胎盘的代谢特征，并讨论这些代谢改变是否与胎羊ECC术后器官功能不全有关。

1 材料与方法

1.1 动物实验动物由山东郓城县大鹏农牧科技有限公司提供。实验动物伦理由广东省人民医院医学伦理委员会批准（伦理批号：No.GDREC2019516A），动物实验过程遵守广东省人民医院动物实验室各项规章制度。10只怀孕的小尾寒羊（孕90～120 d，总孕期148 d）随机分为对照组（n=5）和转流组（n=5）。转流组开胸建立ECC，转流1 h；对照组仅行胸骨切开，不进行ECC，观察1 h。

1.2 动物手术孕羊肌肉注射速眠新0.1 mg/kg行基础麻醉，静脉泵注丙泊酚4～6 mg/（kg·h）维持全身麻醉。然后进行气管插管和呼吸机辅助通气，孕羊动脉氧饱和度维持100%，动脉二氧化碳分压35 mmHg。监测孕羊血压和心率。

超声探查胎羊数量及方位，中线剖腹手术暴露子宫。触诊判断胎羊头部和胸部相对位置，在胸骨附近切开孕羊子宫，暴露胎羊一侧上肢，行腋动脉穿刺置管，监测动脉血压和心率。胎羊行正中胸骨切开术，打开心包暴露心脏。插管前静脉注射肝素钠3～5 mg（根据胎羊大小估计）。以7-0 Prolene（爱惜康）在主肺动脉缝制荷包，插入动脉插管（美敦力6 Fr动脉插管），右心耳以7-0 prolene线缝制带心包扣的荷包，而后插入静脉插管（美敦力12 Fr直头引流管）。ECC采用离心泵（Revolution 5；索林）作为动力系统，人工膜肺（HIITE 800LT；米道斯）和胎盘共同作为氧合器，预充液由150 ml羊血、50 ml乳酸林格液和10 mg肝素组成。转流过程中维持胎羊ECC流量在150 ml/（kg·min）以上，转流时间为1 h。

1.3 超声评估和血液检测在转流开始前（T0）、转流30 min（T1）和转流结束时（T2）对胎羊进行超声心动图检查。记录超声心动图参数，包括左室（left ventricle，LV）-等容收缩时间（isovolemic contraction time，IVCT）、LV-等容舒张时间（isovolemic relaxation time，IVRT）、右室（right ventricle，RV）-IVCT、RV-IVRT、主动脉瓣内径（aortic valve diameter，AVD）、左室流出道（LV outflow tract，LVOT）-速度时间积分（velocity time integral，VTI）、肺动脉瓣内径（pulmonary valve diameter，PVD）、RVOT-VTI、脐动脉搏动指数（Umbilical artery pulsatility index，Ua-PI）、脐动脉阻力指数（Ua resistance index，Ua-RI）。采用公式［Tei指数=（IVCT-IVRT）/IVRT］计算左、右心室Tei指数。左室每搏输出量（stroke volume-LV，SV-LV）由公式［SV-LV=LVOT-VTI×π×（AVD/2）2］得出，SV-RV由公式［SV-RV=RVOTVTI×π×（PVD/2）2］得出。

于T0、T1、T2采集静脉血，进行心肌酶检测，包括肌红蛋白（myoglobin，Myo）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）等；血气分析，包括pH、氧分压、二氧化碳分压、乳酸等。心肌酶检测使用m16磁敏免疫分析仪（深圳理邦）进行，血气分析使用i15血气生化分析仪（深圳理邦）进行。

1.4 组织收集转流结束后，对胎羊实施安乐死，迅速留取胎羊心脏和胎盘的组织标本，液氮速冻后储存在-80℃冰箱直至代谢物提取。实验结束后，将母羊复苏并送回农场。

1.5 代谢物提取和UHPLC-MS/MS分析对冻存的组织样本进行代谢物提取和UHPLC-MS/MS分析，具体操作流程按文献中描述的方法进行［7-8］。

1.6 代谢组学数据处理与分析UHPLC-MS/MS生成的原始数据文件使用Compound Discoverer 3.1（CD3.1，赛默飞）进行峰对齐、峰提取和代谢物定量。之后，将峰强度归一化为总光谱强度，用归一化后的数据进行分子式预测。然后用mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、mzVault和MassList数据库对峰进行匹配，得到定性和相对定量结果。使用统计软件R（R version R-3.4.3）、Python（Python 2.7.6 version）和CentOS（CentOS release 6.6）进行统计分析，当数据不是正态分布时，使用面积归一化方法进行正态转换。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG数 据 库）（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人类代谢（HMDB）数据库（https://hmdb.ca/metabolite）和脂质图结构（LMSD）数据库（http://www.lipidmaps.org/）对鉴定到的代谢物进行注释。多元统计分析部分，使用代谢组学数据处理软件metaX将数据转换后行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），进而得每个代谢物的变量投影重要度（Variable importantce in projection，VIP）值。单变量分析部分，基于t检验来计算各代谢物在两组间统计学显著性（P值），并计算代谢物在两组间的差异倍数（fold change，FC）值。火山图用R包ggplot2绘制。差异代谢物筛选的默认标准为VIP＞1，P值＜0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。筛选完成后，采用MBRole 2.0（http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）［9］对鉴定到的差异代谢物进行富集分析，以寻求显著变化的代谢通路，P＜0.05被认为有统计学意义。

1.7 统计学分析所有分析均采用IBM SPSS Statistics 26.0进行，正态分布资料用均数±标准差（±s）描述，非正态资料用中位数和四分位数描述。组间比较采用重复测量方差分析，组内不同时间点的比较采用配对t检验，非正态分布资料的比较采用非参数检验。P＜0.05被认为有统计学差异。

2 结 果

2.1 动物实验结果转流组和对照组的胎羊体重无明显差异［（2.10±0.59）kg vs.（1.49±0.86）kg，P=0.232］，胎龄无明显差异［（97.00±9.75）d vs.（98.00±13.04）d，P=0.894］。与对照组相比，转流组左右心室的Tei指数明显增加（P＜0.05），并且转流结束时Tei指数明显高于转流前（P＜0.05），提示胎羊心功能受损。转流组SV-RV在转流过程中逐渐下降，与对照组有显著差异（P=0.004）。转流组心率逐渐减慢，与对照组差别明显（P=0.005），转流30 min的心率明显慢于转流前（P=0.027）。转流组在T1和T2的pH值明显高于T0（P＜0.05），与对照组无明显差异（表1）。对照组在T2的PCO2显著高于T0（P=0.013），转流组在T1和T2的PCO2显著低于T0，两组的PCO2变化有统计学差异（P=0.0004）（表1）。转流组乳酸值在转流过程中明显增加，与对照组比较有显著差异（P=0.004）。转流组的Ua-PI、Ua-RI和心肌酶无明显改变，与对照组比较无明显差异（表2）。

表1 胎羊血流动力学参数和转流中的血气值变化（n=5，±s）

表1 胎羊血流动力学参数和转流中的血气值变化（n=5，±s）

注：Ua-PI：脐动脉压力指数；Ua-RI：脐动脉阻力指数；PO2：氧分压；PCO2：二氧化碳分压；Lac：乳酸；*P＜0.05与同组T0相比

对照组转流组项目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2左室Tei指数 0.37±0.09 0.45±0.19 0.52±0.12 0.35±0.06 0.83±0.46 1.68±0.54* 0.049右室Tei指数 0.32±0.02 0.39±0.06 0.43±0.07 0.56±0.13 0.84±0.37 1.41±0.17* 0.003左室每搏量（ml/min） 2.49±0.65 2.38±0.40 2.44±0.38 2.68±0.57 1.91±0.79 1.34±0.72* 0.344右室每搏量（ml/min） 3.03±0.23 2.93±0.19 2.97±0.40 2.53±0.44 1.64±0.22 0.99±0.47 0.004 Ua-PI 1.35±0.46 1.32±0.38 1.36±0.43 1.07±0.39 1.23±0.22 1.25±0.31 0.598 Ua-RI 0.77±0.18 0.75±0.24 0.79±0.23 0.65±0.14 0.70±0.11 0.72±0.11 0.575心率（次/min） 148.67±15.28 133.67±14.84 134.67±10.02 138.50±21.33 88.00±11.17* 74.25±30.50 0.005 pH 7.24±0.06 7.32±0.10 7.27±0.09 7.20±0.06 7.34±0.07* 7.32±0.06* 0.796 PO2（mmHg） 23.00±3.61 25.33±1.15 20.33±1.15 20.00±2.55 24.60±8.44 32.60±16.16 0.576 PCO2（mmHg） 67.43±3.06 75.50±15.00 86.73±6.92* 75.38±12.95 36.60±10.74* 28.88±10.05* 0.0004 Lac（mmol/L） 1.98±0.61 1.56±0.80 1.89±0.59 2.19±0.76 6.53±1.72* 7.58±3.10* 0.004

表2 胎羊血液心肌酶的变化（n=5，±s）

表2 胎羊血液心肌酶的变化（n=5，±s）

注：Myo：肌红蛋白；CKMB：肌酸激酶同工酶

对照组转流组项目P值T0 T1 T2 T0 T1 T2 Myo（μg/L） ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 ＜5.0 -CKMB（μg/L） ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 ＜2.0 -

2.2 代谢组学结果

2.2.1 代谢组学数据稳定性 为确保色谱-质谱系统在实验过程中的稳定性和实验数据的可靠性，在检测目标样本的同时，随机注入三个质控（quality control，QC）样本（QC样本由目标样本混合而来）。QC样本各色谱峰的响应强度和保留时间基本相同，说明色谱-质谱系统在整个实验过程中稳定性良好。然后，利用峰面积计算三个QC样本之间的Pearson相关系数。结果显示（图1），各QC样本间相关系数均大于0.99，说明各QC样本高度相关，代谢组结果稳定且可重复。

图1 QC样本间的Pearson相关系数

2.2.2 多元统计分析 多元统计分析采用PCA和PLS-DA。转流组和对照组的心脏代谢谱基本分离，其95%置信区间仅部分重叠，提示ECC对胎羊的心脏代谢有显著影响（图2A）。转流组和对照组的胎盘代谢存在明显重叠，提示ECC对胎盘代谢的影响较小（图2B）。此外，QC样品集中在目标样品的中间区域，说明QC样品具有良好的重复性和稳定性。 PLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法，可以进一步区分组间的代谢差异，但存在一定的过拟合风险，需要进行排序验证。转流组和对照组的心脏代谢谱在PLS-DA得分图中明显分离（图3A），模型的评价参数R2Y和Q2Y均明显大于0.5，提示模型有良好的稳定性和较高的可预测性，转流组和对照组的心脏代谢有明显差异，在排序检验图中，R2＞0＞Q2，提示该模型未过拟合。转流组和对照组的胎盘代谢谱在PLS-DA得分图中同样明显分离，但其评价参数Q2Y均明显＜0.5，在正极性模式下Q2Y甚至＜0（图3B），提示模型的可预测性和稳定性较差，且存在一定的过拟合，转流组和对照组的胎盘代谢用PLS-DA也不能明显区分，差异较小。

图2 心脏和胎盘在两种极性模式下的主成分分析图

图3 心脏和胎盘在两种极性模式下的偏最小二乘法判别分析图和排序验证图

2.2.3 差异代谢物分析 结合单变量分析和多元统计分析结果，以VIP＞1，P＜0.05，且FC≥1.5或FC≤0.667作为阈值，进行差异代谢物筛选。转流组心脏相对于对照组，共鉴定出225种差异代谢物，其中负极性模式下123种（47种上调，76种下调），正极性模式下102种（47种上调，55种下调）。转流组胎盘相对于对照组，共鉴定出122种差异代谢物，其中负极性模式下66种（14种上调，52种下调），正极性模式下56种（32种上调，2种下调）（图4）。

图4 心脏和胎盘在两种极性模式下的火山图

2.2.4 差异代谢通路分析 利用MBroles 2.0对差异代谢物进行富集分析，显示富集到的差异代谢通路有：糖代谢（三羧酸循环，磷酸戊糖途径）、脂肪酸代谢（丁酸代谢、不饱和脂肪酸代谢）和氨基酸代谢（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，组氨酸代谢，赖氨酸代谢）是ECC胎羊心脏的主要差异代谢途径（图5）。转流组心脏组织中，神经酸、二十二碳三烯酸、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等脂肪酸含量减少，酰基肉碱增加，产物乙酰辅酶A增加，这表明脂肪酸利用明显增加。生糖氨基酸（甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸等）的含量减少，糖代谢的能量底物（果糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖等）含量增加，三羧酸循环中间产物（琥珀酸、α-酮戊二酸、乌头酸等）增加，表明能量代谢增加，糖异生增多。磷酸戊糖途径中间产物（5-磷酸木酮糖、6-磷酸葡萄糖酸等）减少，合成代谢受阻。

转流组胎盘的差异代谢通路主要包括不饱和脂肪酸代谢、花生四烯酸（arachidonate，ARA）代谢、谷胱甘肽代谢等（图5B）。能量代谢方面，胎盘同样表现为糖代谢底物（6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖）的增加以及多种生糖氨基酸和不饱和脂肪酸的减少，说明胎盘能量需求增加，募集的葡萄糖增多。ARA代谢和谷胱甘肽代谢则分别与炎症和氧化应激有关。

图5 心脏和胎盘的通路富集气泡图

3 讨 论

3.1 心功能和胎盘功能本研究选用孕90～120 d的羊构建胎羊ECC模型，平均孕97.5 d，相当于人孕25周，能够较好地模拟人胎儿ECC手术的真实情况。既往动物研究表明，胎儿ECC可导致心功能不全［3］。在本研究中，发现胎羊ECC导致左右心室的Tei指数明显增加，SV和心率显著下降。Tei指数是心室等容时间（包括IVCT和IVRT）与射血时间的比值，在胎儿心功能检测方面不受心室几何形态、心率和胎龄的影响，具有良好的可靠性和重复性［10］。心功能低下时Tei指数显著增高。胎儿心肌收缩成分少，心肌舒张依赖细胞膜上的钠钙交换，因而胎儿心肌收缩和舒张功能比成熟心肌低下。胎儿心肌细胞处于最长肌节状态，根据Frank-Starling定律，增加心脏容量，胎儿心脏每搏量的增加非常有限。因此，胎儿通过增加心率和双心室做功来保持高循环动力状态。在本研究中，转流组胎羊的心率和SV均明显下降，心输出量显著减少。Myo和CKMB是心肌损伤的标志物之一，Myo通常在心肌损伤后1～4 h内升高，在6～9 h达到峰值，CKMB在心肌损伤3～8 h开始升高，在12～24 h达到峰值。由于本研究观察时间仅1 h，因此未观察到Myo和CKMB的显著变化。

胎盘功能障碍是胎儿ECC最常见的术后并发症，具体表现为胎盘血管阻力升高、高碳酸血症和不可逆酸中毒。在本研究中，Ua-PI和Ua-RI无明显改变，并且PCO2逐渐降低，pH明显改善。这可能是因为人工膜肺和胎盘共同作为氧合器，在转流过程中提高了气体交换能力，减轻了胎盘负荷。此外，胎羊ECC导致的胎盘功能恶化通常发生在术后数小时，本研究为获取组织标本，观察时间较短，所以胎盘功能未见明显恶化，但显示血乳酸值在转流过程中显著增加，这表明胎儿的内环境紊乱正在发生。

3.2 心脏代谢与心功能心脏是一种“杂食性”器官，具有很强的底物利用和环境适应能力。在胎儿出生前，心脏以乳酸和葡萄糖作为主要的能量底物，在胎儿出生后，则迅速转化为以脂肪酸代谢为主。这种代谢模式的转变主要是由于出生前胎儿宫内环境的相对缺氧和出生后新生儿能量需求的迅速增加［11］。在本研究观察到转流组胎羊的心脏发生了类似出生后的代谢模式转换：多种脂肪酸含量减少，脂代谢明显增加，三羧酸循环增强。这可能是因为ECC作为一种应激状态，导致转流组胎羊的能量需求增加，脂代谢激活。与糖酵解相比，脂代谢表现出更高的ATP产量，但生产1分子ATP所消耗的氧气更多，这意味着转流组胎羊心肌氧耗增加，负担加重。此外，胎儿心肌细胞的线粒体处于未成熟状态［11］，对氧化损伤的防御机制尚未完善，脂肪酸氧化增加会导致活性氧生成增多，线粒体损伤加重。因此，对于胎儿而言，这种能量代谢模式的转变可能是胎羊ECC术后心功能不全的机制之一。

增加的脂代谢不仅会导致能量代谢紊乱，还会导致生长发育受阻。变化的脂质代谢物多为长链多不饱和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA），包括：DHA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等。Kajimoto等［12］用新生仔猪模型研究体外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）对未成熟心脏代谢的影响，发现ECMO促进未成熟心脏的长链脂肪酸氧化。在本研究中也观察到胎羊ECC促进LCPUFAs的氧化。多不饱和脂肪酸对于胎儿的生长发育是必不可少的。它们不仅是细胞膜的关键组成部分，还是一些代谢物的前体，对炎症和神经元生长有重要作用［13-14］。DHA和ARA缺乏会影响神经元干细胞的增殖和分化，导致胎儿和新生儿神经元细胞的迁移延迟，增加神经发育障碍的风险［15］。EPA、DHA和ARA还可被代谢为类二十烷酸或类二十二烷酸（统称为氧脂素），对维持自稳态至关重要［16］。本研究中，胎羊ECC导致多不饱和脂肪酸的下降，不仅会降低胎羊维持氧化还原平衡和炎症稳态的能力，还有可能对胎羊的神经发育造成不良影响。

氨基酸在胎儿体内的主要功能是为生长发育提供物质基础以及参与氧化反应，当营养缺乏和营养不良时，胎儿体内的氨基酸代谢就会相应增强。转流组心脏存在氨基酸代谢的显著改变，主要表现为生糖氨基酸的含量下降，包括天冬氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺等。转流组胎羊能量需求明显增加，并能较早利用氨基酸进行糖异生，但这种消耗是以合成代谢下降为代价的，长时间应激可能导致蛋白质分解增加和严重的负氮平衡，对胎羊的生长发育造成严重不良影响。

3.3 胎盘代谢与胎盘功能既往动物研究表明，胎儿ECC会导致胎盘功能障碍，可能的机制包括：炎性介质沉积、内皮细胞损伤、一氧化氮（nitric oxide，NO）含量下降、氧化应激等［2-3，17］。本研究采用人工膜肺和胎盘共同作为氧合器，一定程度上减轻了胎盘负荷，并且停机后的观察时间较短，因此未观察到胎盘功能的明显下降。同样，在代谢层面，转流组胎羊的代谢改变不明显。虽然未能将转流组和对照组的胎盘代谢完全区分，但转流组胎盘的一些代谢变化可能预示了即将到来的胎盘损伤。

NO是以精氨酸为底物，以还原型辅酶Ⅱ作为电子供体，由一氧化氮合酶催化生成。精氨酸减少是胎盘功能不良的标志［18］。转流组胎盘的精氨酸（P=0.034）和同型精氨酸（P=0.033）明显减少，NO合成的底物不足，这可能是转流术后胎盘内皮细胞NO合成障碍的新机制。与心脏相同，转流组胎盘同样存在脂肪酸氧化的增加，氧负担加重。本研究采用人工膜肺和胎盘共同作为氧合器，在转流期间对胎盘的气体交换有一定辅助作用，但转流结束后胎盘将面临更重的气体交换负担，这可能是ECC术后胎盘功能恶化的原因之一。此外，脂肪酸氧化增加还会导致氧化应激损伤加重。作为主要的营养运输通道和调节器官，胎盘具有较强的对抗氧化应激损伤的能力。棕榈酸抗坏血酸酯、甜菜碱、还原性谷胱甘肽等具有抗氧化防御能力的代谢物在转流组胎羊的胎盘中均明显增加［19］，表明转流组胎盘虽然面临着氧化应激损伤，但仍在代偿范围内。随着观察时间的延长，这种氧化与抗氧化的平衡可能会被打破，严重的氧化应激可能会进一步损伤胎盘功能。

3.4 不足与展望本研究也存在一些不足。首先，本研究以胎羊为模型探讨胎儿ECC对器官组织代谢的影响，其结果不完全适用于人类胎儿。其次，本研究的动物数量较少，观察时间较短，并且非靶向代谢组学只能进行相对定量，结果可能存在一定误差。应进一步扩大样本量，延长观察时间，并采用靶向代谢组学对结果进行验证。此外，每个器官内部都有不同的细胞类型和功能区域。对于特定的代谢改变，器官可能具有区域特异性。在本研究中，只使用了器官样本的一小部分，不能完全代表整个器官的代谢。空间代谢组学整合质谱成像和代谢组学技术，对动/植物组织和细胞中内/外源性代谢物的种类、含量和差异性空间分布进行精准测定［20］，其应用将更有助于器官代谢的研究。

4 结 论

综上所述，本研究构建了胎羊ECC模型1 h，研究显示胎儿ECC影响心脏和胎盘组织代谢。转流过程中心脏功能明显下降，代谢改变主要变现为脂肪酸氧化和氨基酸分解增强；胎盘功能暂无明显下降，代谢改变不显著，但一些代谢物的变化提示胎盘功能在转流结束后可能将逐渐恶化。本研究首次从代谢的角度对胎羊ECC术后心功能不全和胎盘功能障碍的机制进行了初步探讨，为胎儿ECC研究提供了新方向。