ELOVL6在人卵巢浆液性腺癌组织中的表达及对卵巢癌细胞增殖、侵袭及凋亡能力的影响

李富娟，邢艳霞，杨艳丽，苏英

卵巢浆液性腺癌是卵巢癌的具体病理亚型，主要分为高级别浆液性腺癌和低级别浆液性腺癌[1]。由于卵巢癌早期多无症状，大部分患者发现时已是晚期，并且卵巢癌的总体预后效果较差，一般很难治愈，早期5年生存率较高，晚期容易复发及转移，所以卵巢癌的死亡率高居不下，占各类妇科肿瘤的首位[2-3]。目前卵巢癌的发病机制尚未完全清楚，仍然缺乏病因治疗，因此探究卵巢癌的发病机制和寻找新的治疗药物具有重要的临床意义[4]。研究发现，脂类作为身体重要的营养物质，不仅贮存机体所需能量，而且是细胞周期活动中的重要活性分子，参与细胞间信号传导、细胞炎症因子浸润和细胞侵袭等生物学活动，因此，脂质代谢因子异常与卵巢癌的发生、发展和转移等越来越受到科研人员的关注[5]。超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)是ELOVLs家族基因中的第6个成员，主要参与饱和与单不饱和脂肪酸的延伸，是机体内脂肪酸代谢的关键调控因子[6]。已有研究报道了ELOVL6基因在肝癌发生、发展中的重要调控作用[7]。本研究主要研究ELOVL6基因在卵巢浆液性腺癌中的表达以及从分子水平探讨其对卵巢癌细胞增殖、侵袭、凋亡的生物学功能影响，从而为深入研究ELOVL6与卵巢浆液性腺癌的发病机制提供基础实验依据。

1 材料及方法

1.1 临床资料

选取2018年4月至2020年12月在青海省第五人民医院行卵巢浆液性腺癌术的80例患者，收集其癌组织，其中高级别浆液性腺癌组织(n=55)，低级别浆液性腺癌组织(n=25)，另收集因其他疾病行切除手术的正常卵巢和输卵管组织(n=20)。纳入标准：① 确诊为卵巢浆液性腺癌的患者；② 患者术前未接受放化疗等治疗；③ 本研究经本院伦理委员会批准，所有参与患者均知情并同意。排除标准：① 合并其他恶性肿瘤；② 患有自身免疫病者。

1.2 细胞及其培养

人卵巢癌SKOV3细胞和OAW28细胞购自中国科学院细胞库。SKOV3细胞用10%胎牛血清配置的Mc-Coy’s 5A培养基；OAW28细胞用10%胎牛血清配置的RPMI1640培养基；两种细胞均培养于37℃，5%CO2孵育箱中。

1.3 研究方法

1.3.1 卵巢浆液性腺癌组织中ELOVL6阳性表达率

(1)手术切除患者卵巢病变组织，放入10%福尔马林中固定24 h，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后用石蜡包埋，将蜡块用切片机切成厚度为4 μm的蜡片，放入45℃～55℃清水的展片机中，待完全展开后将其用载玻片捞起，放入60℃烤箱中烘烤2 h。

(2)蜡片脱蜡后用PBS洗片3次，每次10 min，然后加入3% H2O2溶液孵育10 min，PBS清洗3次，37℃封闭10 min，使抗原位点暴露。

(3)封闭后加入ELOVL6一抗4℃孵育过夜，PBS清洗3次，二抗特异性结合一抗，室温孵育2 h，PBS清洗3次；滴加DAB显色液15 min，苏木素复染1 min，脱水，封片。

(4)在光镜下观察，ELOVL6定位于细胞核，出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每个切片选取10个高倍视野计算阳性细胞率(阳性细胞率=阳性细胞数/观察细胞数×100%)，阳性细胞率<10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分;染色程度：无色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。取两组计分之积:0～3为阴性，4～12为阳性。

1.3.2 ELOVL6转染后在卵巢癌细胞中mRNA表达以及对卵巢癌细胞生物学功能的影响

(1)细胞分组与转染

将卵巢癌细胞SKOV3和OAW28分别分成转染组和对照组，均培养于37℃，5%CO2孵育箱中，转染前1 d用0.25%胰蛋白酶消化，用50%的细胞密度进行传代，取对数生长期的细胞按LipofectAMINE 2000转染试剂说明书进行转染，将ELOVL6分别转染至SKOV3和OAW28转染组细胞，转染6 h后换新鲜的培养液继续培养。

(2)qRT-PCR验证转染前后ELOVL6在卵巢癌细胞中的表达

① SKOV3和OAW28细胞RNA提取：取转染前后SKOV3和OAW28卵巢癌细胞加入1 mL Trizol，室温放置5 min充分裂解，在EP管中加入200 μL氯仿，涡旋振荡30 s，室温静置2～3 min后，在4℃，10 000 rpm的条件下离心15 min；取上清液至另一EP管，加入500 μL异丙醇，手动摇匀后在室温条件下静置10 min，接着4℃，10 000 rpm的条件下离心10 min，撇去上清液，底部沉淀即为RNA；EP管内加入预先冰好的75%乙醇，用手轻弹管底的沉淀，待其浮起后，剧烈震荡15 s后离心5 min，撇去上清液，将沉淀室温干燥；加入40 μL的DEPC水，枪头吹打几次，使其溶解；吸取2 μL RNA样品用来检测其纯度，A260/A280的比值一般在1.6～1.8之间，把其余的RNA分装后保存在-80℃冰箱。

② 逆转录合成cDNA：逆转录第一链cDNA的合成使用反转录试剂盒来进行。所有实验操作过程都严格按照说明书来操作。反应体系20 μL，冰上配制反应液。逆转录反应条件：37℃ 15 min(反转录反应)，85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，结束后cDNA置 4℃保存。

③ 定量反应：用逆转录合成的cDNA作为模板，应用SYBR Green Mix进行实时PCR分析。反应体系为20 μL，实时PCR条件：95℃ 10 min，95℃ 2 s，60℃ 20 s，70℃ 10 s，循环40次。

④ 相对定量计算：以U6 RNA作为内参照，根据RT-PCR反应结果中的Ct值，采用相对定量的方法比较，ΔCt=平均Ct目的基因-平均Ct管家基因,ΔΔCt=ΔCt实验样本-ΔCt对照样本,相对量=2-ΔΔCt。

(3)MTT观察转染后卵巢癌细胞增殖能力

分别将SKOV3和OAW28细胞转染组和对照组细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，37℃ 5%CO2孵育箱培养12、24、36、48、72 h，每孔加灭菌后的MTT液20 μL,继续孵育4 h后取出，加入DMSO微微震荡溶解，用酶标仪在波长570 nm处测其吸光值(OD)，吸光值越大则细胞增殖能力越强。

(4)Transwell实验观察转染后卵巢癌细胞侵袭能力

将Transwell放入培养板中，在上室加入Matrigel基质胶，37℃ 30 min形成基质膜，然后分别将100 μL转染组和对照组SKOV3和OAW28细胞接种于Transwell上室，在下室加入500 μL 20% FBS细胞培养液，置于37℃ 5%CO2培养箱中孵育24 h，取出Transwell小室，弃去培养板中的培养液，用棉签擦拭上层未迁移的细胞，用PBS清洗下层细胞3次，用福尔马林固定30 min，适当风干后用0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗，倒置晾干后在光学显微镜下取随机选取5个高倍视野进行细胞计数，数量越多则侵袭能力越强。

(5)流式细胞仪检测转染后卵巢癌细胞凋亡能力

分别取对数生长期转染组和对照组SKOV3、OAW28细胞，经胰蛋白酶消化后，3 000 rpm离心5 min。收集全部细胞至1.5 mL离心管，用PBS缓冲液洗涤2次后，再经3 000 rpm离心5 min，收集细胞，在室温避光下加入5 μL Annexin V-FITC工作液，孵育10 min后，再加入5 μL PI染色液，在同一环境下孵育5 min。加入500 μL PBS并轻轻混合，在1 h内通过流式细胞仪进行检测，激发波长488 nm，检测波长675 nm，使用FL1通道进行检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 卵巢浆液性腺癌患者不同级别癌组织中ELOVL6阳性表达率比较

免疫组化结果显示，ELOVL6在正常卵巢组织中全部呈强阳性表达，而在低级别浆液性腺癌组织中呈弱阳性表达(表达率为44.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常输卵管组织中ELOVL6阳性表达(表达率为90.00%)相比，ELOVL6在高级别浆液性腺癌组织中阳性表达(表达率为54.55%)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1(见彩插1)，表1。

表1 不同级别卵巢癌组织中ELOVL6蛋白阳性表达率比较[n(%)]

2.2 验证ELOVL6转染前后在卵巢癌细胞SKOV3和OAW28中的表达

qRT-PCR结果显示，ELOVL6 mRNA在对照组SKOV3和OAW28卵巢癌细胞中呈低表达，成功转染ELOVL6后，在转染组其mRNA表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：与对照组相比，*P<0.05图2 ELOVL6 mRNA在SKOV3和OAW28卵巢癌细胞中的表达

2.3 ELOVL6对SKOV3和OAW28卵巢癌细胞增殖能力的影响

MTT细胞增殖实验表明，与对照组相比，ELOVL6转染后可以抑制SKOV3和OAW28卵巢癌细胞的增殖。SKOV3细胞在转染后培养36 h，其增殖能力较对照组有显著性下降，差异有统计学意义(P<0.05)，OAW28细胞在转染后培养48 h，其增殖能力较对照组有明显的下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注：与对照组相比，*P<0.05图3 ELOVL6对卵巢癌细胞增殖能力的影响

2.4 ELOVL6对SKOV3和OAW28卵巢癌细胞侵袭能力的影响

Transwell细胞侵袭实验表明，ELOVL6转染后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭。SKOV3转染组细胞穿膜数明显少于对照组细胞穿膜数[(201±9)个 vs (323±12)个]；OAW28转染组细胞穿膜数少于对照组细胞穿膜数[(158±4)个 vs (286±2)个]，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

注：与对照组相比，*P<0.05图4 ELOVL6对卵巢癌细胞侵袭能力的比较

2.5 ELOVL6对SKOV3和OAW28卵巢癌细胞凋亡能力的影响

通过流式细胞检测结果发现，与对照组细胞相比，SKOV3和OAW28转染组细胞凋亡能力增强，ELOVL6能促进卵巢癌细胞凋亡，见下页图5。

注：与对照组相比，**P<0.01图5 ELOVL6对卵巢癌细胞凋亡能力的影响

3 讨论

脂肪是细胞生理学的主要成分，人类可以通过从碳水化合物或蛋白质来源合成脂肪或通过饮食直接摄入获得脂肪，并通过调节它们的新陈代谢来维持机体内环境的平衡，如果这种代谢紊乱则会导致疾病的发展[8]。长期以来由脂肪堆积引起的肥胖一直被怀疑是诱导癌症发生的危险因素，所以有关脂肪代谢与癌症发病机制之间的关系一直是学者们关注的重点[9]。事实上，有研究已经指出脂肪堆积为食道癌、结肠癌、子宫癌、肾癌和绝经后乳腺癌的病因，也是前列腺癌、胰腺癌和卵巢癌的重要危险因素[10]。据统计，全世界大约16%～20%的女性和14%的男性癌症死亡是由肥胖引起的[11]。此外，许多研究表明，有关脂肪合成或脂肪氧化基因的异常表达会造成肿瘤细胞的转移、治疗抵抗和复发，使得对癌症患者难以进行靶向治疗，增加了癌症研究的挑战性[12]。然而，关于脂肪代谢和卵巢癌这两个生物学过程之间的调节关系并没有明确的结论，本研究主要针对ELOVL6对卵巢浆液性腺癌的调控机制进行初步探讨，争取为卵巢癌的临床治疗提供实验依据。

ELOVL6作为脂肪酸代谢的关键调控因子，在催化C12～C16脂肪酸延长反应中起限速作用[13]。有研究报道，棕榈酸C16在癌细胞的生长和繁殖过程中发挥着供能的作用，在卵巢癌细胞中棕榈酸表达显著升高，当敲除小鼠体内的ELOVL6基因后，可以终止C16向C18转变的过程，从而抑制癌细胞的增长[14]。体外实验研究发现，ELOVL6基因在正常细胞中均呈现高表达，而在癌细胞中其表达水平显著下降，并且表达水平与细胞分化程度呈正相关；在病理等级分期中I+II期表达水平明显高于III+Ⅳ期，这就说明ELOVL6与病理发展等级呈负相关[15]。在本研究中我们分别观察了卵巢浆液性腺癌患者组织中ELOVL6的阳性表达和卵巢癌细胞SKOV3和OAW28中mRNA表达，发现在正常组织或细胞中ELOVL6表达显著，而在卵巢癌组织或细胞中表达水平明显降低，这与文献报道结果一致。还有研究发现，AMPK/mTOR通路是介导细胞增殖、分化和凋亡的关键枢纽，ELOVL6可以通过下调细胞周期抑制因子p53和p21来降低mTOR磷酸化，进而干扰肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，发挥抑癌的作用[16]。另外，PI3K/AKT通路是调节脂质代谢和细胞增殖分化的重要通路，通过干扰ELOVL6可以降低AKT磷酸化活性，进而抑制癌细胞的增殖[17]。本研究通过MTT和Transwell观察到ELOVL6有抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的作用，流式检测结果表明，ELOVL6高表达能促进卵巢癌细胞的凋亡，与文献报道结果相吻合。

综上所述，ELOVL6蛋白与卵巢癌的发生密切相关，其在卵巢癌组织中呈弱阳性表达，恢复ELOVL6表达水平，可以抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移，促进癌细胞凋亡，为临床治疗卵巢癌提供理论依据。但本研究只选择了卵巢浆液性腺癌这一种病理亚型，研究范围较窄，且样本数量较少，在后续研究中还需扩大样本数量，选择多种卵巢癌病理类型，以期更深入的阐明卵巢癌发生发展的分子机制。