纳米药物在肝纤维化上的研究进展

陈重庆，查正宝，王 华

(1. 安徽医科大学药学院，安徽 合肥 230032；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009；3.安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，安徽 合肥 230031；4.安徽医科大学炎症免疫性疾病安徽省实验室，安徽 合肥 230032)

肝纤维化是一个对分子、细胞和组织进行高度整合的动态的过程，其主要特征表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分的过量积累[1]。在临床上至今尚未开发出特异性逆转或阻止肝纤维化进展的药物。

肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)最早是由Carl von Kupffer于1876年发现，其主要分布在肝窦内皮细胞和肝细胞之间的Disse间隙，约占所有常驻肝细胞的10%，HSCs最独特的特征是在细胞质内有含有大量的维生素A和甘油三酯的脂滴[2]。在正常肝脏中，HSCs会保持一种非增殖、静止的表型，而当肝损伤后，肝细胞发生凋亡或坏死，随之释放促炎细胞因子和促纤维化细胞因子，刺激炎症细胞在肝脏中募集和激活，此时的HSCs被激活，从储存维生素A的细胞转变为肌成纤维细胞，并具有增殖、收缩、趋化功能，进而产生过量的ECM成分，积聚在肝实质细胞中，破坏肝脏结构，形成特有的瘢痕组织[3]。目前的研究表明，HSCs激活增殖是肝纤维化中的一个重要事件， 抑制HSCs激活是促进肝纤维化逆转的关键[4]。

随着纳米给药技术的进步和应用，专注于治疗肝纤维化的纳米药物与日俱增，根据纳米粒子的天然特性，一般可分为无机纳米粒子和有机纳米粒子[5]。纳米粒子体积很小，可以在人体内更自由地移动，通过静脉注射，甚至可以实现从胞质递送到单个靶细胞。因此，研究使用纳米技术将治疗药物靶向输送至肝脏病灶部位，从而治疗肝纤维化将具有很好的前景[6]。近些年对纳米药物的开发多集中于靶向肝脏纤维化组织区域的局部药物递送，而关于如何实现靶向给药，目前主要采用两种策略，一种是优化纳米粒子的物理化学性质，如表面电荷、形状和尺寸，另一种方法是在纳米粒子表面修饰上靶细胞能够识别的化学官能团[7]，具有多种特异性过表达受体类型的HSCs是主要研究的靶点[6]。本文对近几年研究的作用于HSCs上的无机纳米药物和有机纳米药物进行了总结，综述了目前纳米药物在抑制HSCs激活进而治疗肝纤维化的一些应用研究，相关纳米药物实例见Fig 1。

Fig 1 Nano-drugs acting on hepatic stellate cells to treat liver fibrosis

1 无机纳米药物

在治疗肝纤维化研究中根据材料属性的不同，可以将无机纳米粒子分为金、磁性氧化铁纳米颗粒等金属类材料以及二氧化钛、二氧化硅纳米颗粒等非金属类材料。无机纳米药物依赖其独特的材料和结构所赋予的物理化学性质而引起了广泛关注，这是有机纳米药物所不可能实现的[5]。

1.1 金属类无机纳米药物有丝分裂原血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及其受体-β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)在HSCs活化中起着重要的作用，有可能作为抗纤维化治疗的新靶点[8]。金纳米颗粒(gold-based nanoparticle，GNP) 具有高电子密度、催化作用、介电特性等优点，可以被动地在肝脏积累，在肝脏疾病的治疗上具有巨大的潜力；此外，GNP具有光热特性，通过对特定的细胞输送，可以诱导局部近红外光介导的热消融促使细胞失活[9]。Ribera等[9]设计了一种包被PDGFR-β的金纳米棒，简称GNR-PDGFR-β，其以激活的HSs为靶点，通过选择性光热消融致使HSCs失活，减轻了在四氯化碳造模诱导的小鼠肝纤维化、炎症和肝细胞损伤。GNR-PDGFR-β这种新型纳米材料介导的光热疗法不同于传统的药物治疗，它可以有效地将光能转化为热能，在激活的HSCs积聚并诱导其死亡，最大限度地减少对周围组织的损伤，这是在肝纤维化领域的一项重大创新。

有研究表明成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)在纤维化相关疾病中起到抗纤维化的作用，并且能促进组织再生。FGF2主要同成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)相互作用，在活化的HSCs中高表达，并抑制其激活[10]。Kurniawan等[10]通过碳二亚胺化学偶联的方法将FGF2偶联到超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)上。在四氯化碳诱导的小鼠早期肝纤维化模型中，通过静脉给药FGF2-SPIONs，发现HSCs激活的标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和结蛋白的表达显著降低，FGF2-SPIONs明显抑制了HSCs的激活、迁移、收缩以及胶原的产生。FGF2-SPIONs这种超顺磁性氧化铁纳米颗粒使FGF2的稳定性增加，改善了FGF2在肝脏的蓄积，同时提高了其对HSCs的靶向性，这是第一个尝试向患病肝脏递送FGF2的研究，该纳米给药系统值得在更多的肝纤维化模型中进一步探索。

1.2 非金属类无机纳米药物二氧化铈纳米颗粒(cerium dioxide nanoparticles，CeO2NPs)已被证明具有清除自由基清除和抗炎的作用[11]。然而，CeO2NPs对肝脏疾病是否有治疗价值尚不清楚。Oró等[11]发现在四氯化碳造模的肝纤维化大鼠模型中，静脉注射CeO2NPs，通过全身成像发现其主要分布于肝脏，且与模型组小鼠相比可明显减轻肝脏脂肪变性和门静脉高压，降低大多数炎症因子的表达，HSCs活化的标志物α-SMA的表达也显著降低。这说明CeO2NPs对慢性肝病的治疗有一定的研究价值。

二氧化钛纳米颗粒(titanium dioxide nanoparticles， TiO2NPs)和二氧化硅纳米颗粒(silica nanoparticles，SiO2NPs)近年来被用作一种活性抑制剂，因为它们特殊的物理化学性质，可以靶向HSCs来阻止纤维化及其相关表型的表达[12]。Peng等[12]研究了不同粒径的TiO2NPs以及SiO2NPs对HSCs激活模型LX-2细胞增殖、黏附和迁移的影响，实验发现，使用TiO2NPs、SiO2NPs之后由转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)激活的HSCs产生的纤维化标志物如I型胶原(type I collagen，COL-I)、α-SMA的基因和蛋白表达的生化指标均降低，即使在很低的浓度下，这些纤维化标志物的表达也没有恢复到其激活水平，这提示了TiO2NPs、SiO2NPs具有持续的效应，而这可能因为它们能在细胞内持续累积摄取。此外，通过调控上皮-间充质转化基因(epithelial-mesenchymal transition，EMT)可以进一步抑制TGF-β激活的LX-2细胞在纳米材料处理下的黏附和迁移特性，使其恢复到更安静的状态。总而言之，这些实验为TiO2NPs、SiO2NPs作为治疗体内纤维化的潜在治疗抑制剂提供了证据。

2 有机纳米药物

有机纳米药物可以描述为由有机化合物(包括聚合物纳米粒子、脂质体、脂质纳米粒、聚合物胶束等)组成的药物载体系统。除了具有良好的生物相容性，这些纳米颗粒还可以包裹和保护活性化合物，使其免受低pH环境或胃肠道酶降解的影响[13]。

2.1 聚合物纳米粒子纳米粒通常被定义为粒径在1～100 nm之间的粒子，许多高分子聚合物可用于制备纳米粒。聚合物纳米粒子(polymer nanoparticles，PNPs)具有可以减少毒副作用、保护药物不在体内被降解、提高患者依从性以及达到更有利的药物药代动力学等特点[14]，在对其表面进行修饰后，可以实现肝纤维化的靶向治疗。

索拉非尼(sorafenib，SOR)是FDA批准的一种治疗晚期肝癌的化学药物，最近有报道其可以通过抑制HSCs的增殖来减轻肝纤维化。然而，SOR不溶于水，使得其生物利用度低，严重影响其治疗效果[15]。miR-155是一种典型的多功能微小RNA(microRNA，miRNA)，在炎症过程中发挥关键作用，可以将抗炎的M2巨噬细胞表型极化为促炎的M1巨噬细胞表型[16]。Wu等[17]开发了一种新型的含氟聚合物FP2M/PBA，以氟化链作为桥梁来交联阳离子组分，形成氟化链分布在聚合物主链上的聚合物纳米粒子，并且通过负载高载药量的SOR和miR-155抑制剂制备成一种新型纳米颗粒。研究者发现miR-155与促炎反应或HSCs增殖相关的靶基因存在一定的联系，这种聚合物纳米粒子通过SOR联合抗miR-155基因治疗，将库普弗细胞(kupffer cells，KCs)从促炎的M1表型极化为抗炎的M2表型，同时通过抑制HSCs增殖来间接影响HSCs的激活。这种通过对KCs和HSCs的双重调控来提高疗效和预防肝纤维化复发的方法将会是未来治疗肝纤维化的一条新思路。

吉马酮(germacrone，GMO)是中药姜黄中的主要活性成分之一。主要成分是GMO的复方鳖甲软肝丸已被国家食品药品监督管理局批准为第一个抗纤维化药物[18]。最近有报道，miR-29b家族在HSCs活化和肝纤维化发生发展过程中显著下调，因此通过恢复细胞内miR-29b的水平，可以从多个水平抑制肝纤维化信号转导和ECM蛋白的表达，进而可能减轻肝纤维化[19]。De等[19]首次以聚乙二醇-嵌段-聚丙交酯-乙交酯((ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA)为载体，将GMO和miR-29b共包裹成纳米粒子，然后用环状RGD肽(cyclic RGD peptides，cRGDfK)修饰纳米颗粒，形成G/R-RGD-NPs。整合素属于异源二聚体细胞表面受体大家族，可以调节细胞黏附并对细胞外基质作出反应[20]。cRGDfK是结合整合素αvβ3，增强肝纤维化靶向性的有效配体，cRGDfK修饰的负载GMO和miR-29b的聚合物纳米粒子对活化的HSCs有很强的细胞毒作用，并显著抑制COL-I的产生，并且G/R-RGD-NPs与游离GMO相比对肝纤维化小鼠具有更强的靶向性，其可能成为一种新的、有效的治疗肝纤维化的临床选择。

2.2 脂质体脂质体具有双层膜结构，可以同时包封疏水性药物和亲水性药物，其中疏水性药物纳入双层膜中，亲水性药物被包裹在脂质膜形成的水核中。脂质体具备高生物相容性、高生物降解性、低免疫原性、延长药物半衰期、降低毒副作用等优点，是很好的药物载体[21]。

维莫德吉(vismodegib，VIS)是一种Hedgehog(Hh)抑制剂，最初被用来治疗肝癌，已经被证明通过抑制HSCs活化来减轻肝纤维化[22]。然而，VIS的一些不良特性，如水不溶性、半衰期短以及对正常细胞和非HSCs的毒副作用，限制了其治疗效果[23]。因此，需要一种新的策略来提高VIS疗效并减少其副作用。Li等[20]建立了一个空间稳定的脂质体，该脂质体含有与整合素αvβ3具有高亲和力的环肽(cyclo [Arg-Gly-Asp-Dtyr-Lys]，cRGDyK)，实验发现 cRGDyK引导的脂质体(cRGDyK-guided liposome，RGD-Lip)，在体内能被激活的HSCs优先内化，在激活的HSCs中，RGD-Lip荧光定位与αvβ3大部分重叠，而当使用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除αv或β3之后大大降低了对RGD-Lip的摄取，这表明激活的HSCs对RGD-Lip的摄取是由整合素αvβ3介导的。实验发现RGD-Lip对激活的HSCs比静止的HSCs表现出很高的选择性，并且会优先在纤维化的肝脏中积累，当负载VIS时，RGD-Lip特异性地抑制激活的HSCs中Hh通路信号的表达，在体内和体外均显示出良好的抑制HSCs活性的作用。并且除了VIS，RGD-Lip还可以用于向激活的HSCs输送其他治疗药物或基因，这显示了该纳米系统为未来在治疗肝纤维化上有巨大的潜力。

吡非尼酮(pirfenidone，PF)是一种经美国食品和药物管理局批准用于特发性肺纤维化的新型抗纤维化药。但是如果口服给药，会引起严重的胃肠道副作用。而且，单独使用PF没有靶向性。因此需要一种新的给药系统来减少其副作用，增强靶向性。AMD3100是一种C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)的拮抗剂，已被美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局批准可在临床上用于淋巴瘤和多发性骨髓瘤疾病的治疗。有研究表明CXCR4是基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)特异性受体，在肝纤维化小鼠模型，抑制激活的HSCs中SDF-1α/CXCR4轴可能是治疗肝纤维化的一条潜在选择[24]。Ullah等[24]采用薄膜水合法将PF和AMD3100共包裹在CXCR4靶向复合脂质体(CXCR4 targeted combination liposome，CTC-Lip)中。在体外实验中，与游离的PF、AMD3100相比，CTC-Lip提高了细胞存活率，降低了药物的毒性，并且CTC-Lip促使TGF-β诱导活化的HSCs凋亡，同时可阻断SDF-1α/CXCR4轴的上调，显著降低α-SMA、CXCR4、TGF-β的表达。总之，采用CTC-Lip的联合用药可以成为治疗肝纤维化一种新的策略。

2.3 脂质纳米粒脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNPs)，是构成脂质体的磷脂囊泡，由脂质双层组成，具有中空结构。LNPs可以提高药物的吸收和生物利用度，它们可以跨过血脑屏障， 延长在体内循环时间，其所采用的脂类可以将药物载体的细胞毒性降至最低，并且整个纳米药物载体提高了药物的稳定性和承载力， 阻止药物的渗漏[25]。

松弛素(relaxin，RLN)是一种抗纤维化多肽激素，先前的研究认为其可以直接逆转HSCs的激活，从而缓解肝纤维化。松弛素受体主要由KCs表达，在与松弛素结合后，KCs从促纤维化发生表型转变为纤维化溶解表型，后者可以通过miR-30a-5p释放外泌体，一旦被激活的HSCs摄取，它就以凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)为靶点，并且可以克服过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)的缺乏，PPAR-γ是由促纤维原活化引起的，通过上调PPAR-γ表达，最终使激活的HSCs对RLN介导的失活敏感，促使激活HSCs恢复静止状态[26]。在这些实验的基础上，Hu等[26]开发了一种包裹RLN基因和miR-30a-5p模拟物的脂质纳米颗粒，它会优先靶向纤维化肝脏中激活的HSCs，进而治疗肝纤维化。实验证明了miR-30a-5p对激活的HSCs的靶向递送与RLN基因治疗具有协同作用，并且靶向RLN基因治疗肝纤维化是一种高效、安全、多功能的新方式，在未来的临床应用中很有前景。

高迁移率族蛋白-1(high mobility group protein-1，HMGB1)是一种促炎细胞因子和成纤维细胞趋化因子，可促进HSCs增殖。siRNA也在临床试验中证明了其有基因沉默的潜力，但是需要一种合适的药物载体完成siRNA在细胞内的递送，减少它的酶降解和快速清除[27]。Zhang等[27]制备了pPB肽(C*SRNLIDC*)修饰的HMGB1-siRNA负载稳定的核酸脂质纳米粒(HMGB1-siRNA@SNALP-pPB)。本实验发现HMGB1-siRNA@SNALP-pPB在pPB肽的介导下能特异性靶向HSCs，沉默HMGB1基因的表达，抑制HMGB1蛋白的激活和增殖，同时也抑制多种炎症因子的表达以及肝组织胶原沉积，并且在硫代乙酰胺以及四氯化碳诱导的肝纤维化模型中能显著延长小鼠的存活时间。这种具有抗纤维化和抗炎的双重效果的脂质纳米粒为今后肝纤维化治疗策略的制定提供了有价值的思路和科学的依据。

2.4 聚合物胶束聚合物胶束(polymeric micelles，PMs)是一种自组装的胶体粒子，具有亲水性头部和疏水性尾部，由于其在生物体系中能达到超过临界胶束浓度的特性，大大提高了药物的溶解性、渗透性和生物利用度[28]。

CD44作为一种介导细胞与细胞间、细胞与基质黏附的黏附因子，在活化的HSCs和各种肿瘤细胞上特异性地过表达。与CD44特异相互作用的天然底物包括透明质酸(hyaluronic acid，HA)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)。CS作为细胞外基质的一部分，是一种线性多糖，具有较好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等特点[29]。Luo等[29]在实验中先合成硫酸软骨素纳米胶束-脱氧胆酸偶合物(chondroitin sulfate deoxycholic acid conjugate，CS-DOCA)，之后将维甲酸(retinoic acid，RA)和阿霉素(doxorubicin，DOX)包埋在CS胶束中，形成DOX + RA-CS胶束共给药载体。在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，尾静脉注射DOX + RA-CS胶束后发现CS胶束可以通过CD44受体介导的内化途径发生内吞，选择性积聚在CD44高表达的激活的HSCs中，之后通过高尔基体介导的N-乙酰半乳糖胺转移酶(golgi mediated by N-Acetylgalac-tosaminyl transferase，GalNAc-T)，CS胶束选择性靶向激活的HSCs的高尔基体。其中RA可以破坏激活的HSCs的高尔基体结构、抑制胶原合成，而小剂量的DOX可以通过破坏DNA功能诱导激活的HSCs死亡。这说明表明DOX + RA-CS胶束共给药系统是一种非常有前途的抗肝纤维化的靶向药物。

有意思的是，纳米药物在运送到靶部位的过程中也存在一定的困难。与肝纤维化相关的纤维化胶原(主要是COL-I)在Disse间隙的过度沉积会明显阻碍纳米制剂向HSCs的输送[30]。Fan等[30]以聚(乳酸-乙醇酸)-b-聚乙二醇-马来酰亚胺(poly-(lactic-coglycolic)-b-poly(ethylene glycol)-maleimide，PLGA-PEG-Mal)为基础，制备了一种胶原酶I和维生素A共同修饰的聚合物胶束，其具有纳米钻孔形态，并且能够靶向HSCs，简称CRM。在纤维化的肝脏中，修饰CRM的I型胶原酶可以促进其对纤维化ECM的渗透，而CRM表面修饰的维生素A可以使其可以有效地被识别并靶向HSCs。当遇到I型胶原蛋白屏障时，CRM发挥了类似于纳米钻探的功能，有效地降解了细胞周围的I型胶原蛋白。在体外实验发现与其他胶束制剂相比其更容易被LX-2细胞摄取的能力，同时在小鼠肝纤维化模型中，CRM也可以实现在肝纤维化组织中的良好蓄积以及精确靶向激活的HSCs。此外CRM在体外具有良好的细胞相容性和血液相容性，在体内也没有急性或慢性毒性。这些研究提示CRM是一种理想的HSCs靶向纳米给药系统，I型胶原酶修饰有望成为构建更高效的HSCs靶向纳米给药系统的新策略。

3 小结

肝纤维化是机体在各种病因下所致肝损伤后的创伤愈合反应，损伤部位被大量的ECM所包围，而HSCs是ECM产生的主要来源，其在肝纤维化的发展过程中占据着举足轻重的地位。传统的抗纤维化药物如SOR、VIS、PF等存在溶解度低、无特异性靶向、会造成一定的不良反应等问题，大大降低了其在体内的治疗效率。本文提到的无机纳米药物和有机纳米药物具有良好的可修饰性、靶向性，在治疗纤维化的研究中具有广阔的应用前景。然而，目前对纳米药物的研究还处在临床研究阶段，纳米药物的降解产物存在着一定的毒性， 其代谢产物的副作用暂时也无法彻底地消除；并且纳米药物在到达肝脏后，机体酶会使其在肝脏内变得极不稳定，很容易产生一系列排斥反应。因此对纳米药物的功能进行进一步优化，改善其生物相容性，降低免疫排斥反应和毒性作用将会是未来治疗肝纤维化药物研究的重点。