抗米勒管激素测定试剂盒性能验证

马刚 丁方 胡锦婷 郭艳丽 安徽省食品药品检验研究院 （安徽 合肥 230000）

内容提要： 目的：对罗氏的AMH试剂盒进行性能验证，评估其是否满足临床应用。方法：参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）的标准要求，制定方案，对罗氏AMH试剂盒的准确度、精密度、线性范围、临床可报道范围、参考区间等性能进行验证，比较厂家试剂盒说明书，评价其性能是否通过验证。结果：准确度验证其检测结果与理论值的相对偏倚均在5%范围以内，未超过厂家及临床的允许范围；试剂批内精密度均＜2.00%，均＜5.00%，符合厂家说明书要求；在厂家说明书0.01～23ng/mL的线性范围内，试剂线性较好，符合临床应用标准；试剂最大稀释倍数为64倍，临床最大可报告范围浓度为1472ng/mL，最低检测限为0.0011；参考范围验证表明检测值均在厂家说明书提供的参考区间范围内。结论：试剂盒的准确度、精密度、线性范围、临床可报道范围、参考区间等性能符合厂家说明书所公布的性能，满足临床检验应用。

抗米勒管激素（Anti-MÜLlerian Hormone，AMH）自1930年发现以来，其临床检测意义广泛，主要包括以下几点，AMH由卵巢分泌，与卵巢功能关联紧密，最为典型的是它可以评估卵巢的储备能力，直接反映女性的生育能力，其水平随着年龄的增加而下降，其次AMH水平与卵巢早衰相关联，是不孕症诊治的理想判断指标[1-3]；同时，临床中也应用于女性绝经年龄预测、乳腺癌、多囊卵巢综合征等疾病中的应用，因此AMH 的检测至关重要[4,5]。国内临床中AMH的检测主要依靠于AMH检测试剂盒，其试剂盒的性能与临床中疾病的诊治密切相关，因此试剂盒性能验证具有必要性，本研究对罗氏生物AMH检测试剂盒进行了试剂盒性能验证分析，包括其准确度、精密度、线性范围、临床可报告范围、参考区间等性能，分析改试剂盒性能是否良好，符合临床使用标准。

1.资料与方法

1.1 临床资料

健康人群血清样本来自医院体检中心的健康体检者，排除有感染、肿瘤、心脑血管疾病等重大疾病的体检者，最终获取20例健康体检者血样，样本无溶血、脂血及黄疸等情况，其中男性11例，女性9例，血样均为清晨空腹12h后采集的静脉血5mL，4000r/min离心3min，取上清检测并记录健康体检者的年龄、性别等基本信息。定值血清随机采购罗氏高、中、低三个浓度范围的定值血清各5支，血清浓度范围0.01～23ng/mL，符合试剂厂家说明书浓度范围。

1.2 仪器与试剂

试剂、校准品及质控品均采用罗氏公司生产的AMH配套试剂盒，按其说明书操作，用罗氏Cobas6000全自动免疫分析仪检测、分析、统计数据。

1.3 测定方法

1.3.1 准确度验证

采用厂家罗氏的AMH定值血清，编号分别为20210026、20210027、20210028、20210029，用于准确度性能测定，每支血清连续测定3次计算实测均值，与理论值比对，计算偏差和相对偏倚，其中偏差=实测均值-理论值，相对偏倚=偏差/理论值×100%，根据厂家说明书准确性的相对偏倚范围＜10%，临床应用要求试剂准确度相对偏倚范围＜15%，判断此试剂的准确度验证是否通过。

1.3.2 精密度验证

精密度验证采用厂家的AMH水平定值血清及质控，分别为水平1、水平2定值血清、质控品1、质控品2，验证分为批内精密度和批间精密度验证，其中批内精密度验证将水平1、水平2定值血清、质控品1、质控品2连续重复测定10次，计算各自批内均值、批内标准差、批内变异系数，其中变异系数（CV）=标准差/均值×100%，批间精密度采用3个不同批次的试剂，对水平1、水平2定值血清、质控品1、质控品2连续重复测定10次，计算3批试剂检测的批间均值、批间标准差及其变异系数，根据厂家说明书批内精密度的2.00%，批间精密度5.00%的标准，临床应用要求批内精密度、批间精密度＜10%的标准，判断此试剂精密度是否符合要求。

1.3.3 线性范围验证

根据厂家说明书0.01～23ng/mL的线性范围，选取接近线性上限和下限的高值（H）、低值（L）定值血清样本，按0H:5L、1H:4L、2H:3L、3H:2L、4H:1L、5H:0L的比例梯度配制，计算其每个梯度的理论值，将每个梯度连续测定3次，计算实测均值，以实测均值为因变量，理论值为自变量，进行线性回归分析，计算其回归方程式，依据厂家说明书要求样本浓度在0.046～16.5ng/mL范围内线性r值＞0.976，在0.046～3.99ng/mL浓度范围内线性r值＞0.966，临床应用要求r值＞0.975时表明此浓度范围内，试剂线性良好的标准，判断试剂线性范围是否符合标准。

1.3.4 临床可报告范围验证

依据厂家的线性范围，采用厂家的高值定值血清样本，以4倍梯度，依次稀释至4、16、64、256倍，将每个梯度依次连续重复测定3次，计算实测均值，相对偏倚，依据厂家相对偏倚＜10%的标准判断各梯度测定是否有效，以高值血清浓度乘以最大有效稀释倍数计算临床可报告最大范围浓度，采用低值质控品以4倍梯度，依次稀释，每个梯度依次连续重复测定3次，计算实测均值，看最低检测值是否在厂家试剂盒检出限＜0.01ng/mL的范围内。

1.3.5 参考区间验证

随机选取20个健康体检人群血清样本，每个人的AMH值重复测定3次，取实测均值，按说明书上给出的参考区间，依据记录的健康体检者的年龄、性别信息依次对应至说明书中的参考区间，判断随机抽选的人员测定浓度是否在参考区间内。

1.4 统计学分析

数据处理均采用Excel 2003软件进行平均值、标准差、相对偏倚、变异系数及线性回归分析。

2.结果

2.1 准确性验证

通过标准品检测结果可知，罗氏试剂的检测结果与理论值的相对偏倚均在10%范围以内，未超出厂家统计结果的允许范围，因此试剂准确度性能验证通过，详见表1。

表1.准确性验证

2.2 精密度验证

水平1、水平2及试剂盒配套质控品1、质控品2批内精密度分别为1.1%、1.5%、1.06%、0.97%，均小于厂家说明书批内精密度的2%标准，符合要求，批间内精密度分别为2.7%、2.88%、3.46%、4.17%，均小于厂家说明书批间内精密度的5%标准，符合要求。见表2。

表2.精密度验证结果(ng/mL)

2.3 线性范围验证

试剂盒线性范围为0.01～23ng/mL，选定接近线性的高值和低值按比例稀释，依次测定，每个梯度测定3次，取实测均值为因变量，理论值为自变量，计算线性回归方程Y=0.986X-0.288（r2=0.998），符合厂家试剂说明书的要求，在0.01～23ng/mL浓度范围线性较好。

2.4 临床可报告范围验证

高值定值血清样本按4倍梯度稀释，通过3次测定，计算实测均值，测定结果表明高值样本稀释至256倍时，相对偏倚超出厂家范围，因此试剂的最大稀释比例为1:64，依据试剂线性范围0.01～23ng/mL，试剂临床最大可报告范围上限为1472ng/mL，低值质控品依次稀释，每个浓度检测3次，结果显示最低检测限为0.0011，符合厂家试剂盒检出限＜0.01ng/mL的要求。具体数据见表3。

表3.AMH临床可报告范围验证

2.5 参考区间验证

随机抽取20例健康人群样本检测，其中男性9人，年龄35～78 岁，女性11 人，年 龄23～47 岁，男 性AMH 的测定浓度范围为7.63～15.93ng/mL，女性测定的浓度范围为5.11～12.17ng/mL，均在厂家的说明书参考区间范围内。

3.讨论

随着社会的快节奏发展，高龄化产妇的比例不断增加，多囊卵巢综合征、卵巢早衰、卵巢肿瘤等卵巢疾病是育龄期女性常见的内分泌和代谢疾病，早期的预防与诊断，并配合治疗，临床中治疗效果一般良好，一般提倡早发现、早治疗[6,7]。相比于传统的雌二醇、促卵泡激素、黄体生成素水平的检测，AMH作为早期卵泡的直接产物，能够发现并预测妇女卵巢储备的变化，在诊治卵巢疾病、评估药物治疗对患者卵巢功能的影响中具有十分明显的优势。因此AMH是目前预测卵巢反应、评估卵巢贮备功能的最理想生物标志物[8,9]。

此罗氏的AMH检测试剂盒，其性能参数均是由厂家在实验室的最适条件下检测完成的，虽然厂家说明书中给出各项性能指标，但在临床的常规环境中使用是否满足说明书中的性能指标，仍需进行验证。因此本研究对罗氏AMH检测试剂盒进行试剂盒性能验证，包括准确度、精密度、线性范围、临床可报告范围、参考区间等性能，分析其试剂盒性能是否符合临床要求。

准确性验证结果表明，检测结果与理论值的相对偏倚均在10%范围以内，未超出厂家说明书的允许范围，因此试剂准确度性能验证通过。精密度验证结果显示，水平1、水平2及试剂盒配套质控品1、质控品2批内精密度分别为1.1%、1.5%、1.06%、0.97%，均小于厂家说明书批内精密度的2%标准，符合要求，批间内精密度分别为2.7%、2.88%、3.46%、4.17%，均小于厂家说明书批间内精密度的5%标准，精密度均符合厂家及临床要求。线性范围的回归方程为Y=0.986X-0.288（r2=0.998），符合厂家试剂说明书的要求，在说明书线性范围内此试剂盒线性较好。线性范围结果表明，当高值样本稀释至256倍时，相对偏倚超出厂家范围，因此试剂的最大稀释比例为1:64，试剂盒临床最大可报告范围上限为1472ng/mL，最低下限为0.0011，既符合厂家说明书的要求，也符合临床应用范围。参考区间验证结果表明，此参考区间适用于本地区人群参考区间范围，由于实际临床中大多数实验室都不建立本区域的参考区间，仅验证厂家说明书的参考区间是否适用于本实验室，因此可直接应用厂家说明书所提供的参考区间。

综上所述，在罗氏Cobas6000全自动免疫分析仪对罗氏的AMH检测试剂盒进行性能验证，其试剂盒的准确性、精密度、线性范围、参考区间与厂家所给说明书的数据相符合，能够满足临床应用。