叶酸受体阳性循环肿瘤细胞在卵巢癌辅助诊断和疗效监测中的应用价值

汪 莹, 申复进, 郑红云, 冯 丹

(武汉大学人民医院, 1. 妇产科, 2. 检验科, 湖北 武汉, 430060)

卵巢癌是临床常见的妇科恶性肿瘤疾病，发病率和病死率分别居妇科恶性肿瘤的第3位和第1位[1]。卵巢癌患者早期临床症状和体征不明显，超过75%的患者确诊时已发展至晚期，其5年生存率低于25%[2]。糖类抗原125(CA125)是卵巢癌常用生物标志物，但其也可在子宫内膜异位症、肺癌[3]等疾病患者中高表达，用作筛查工具缺乏特异性。人附睾蛋白4(HE4)在卵巢癌中呈高表达，在卵巢良性肿瘤或非卵巢癌中呈低表达或不表达，相较于CA125具有更高的特异性[4]。临床医师常用HE4联合CA125检测结果对卵巢癌进行诊断，其敏感性高于单一检测结果，但诊断早期卵巢癌仍有不足[5]。因此，临床亟需探寻新的生物标志物用于卵巢癌的筛查及初步诊断。近年来，外周血循环肿瘤细胞(CTC)被逐步应用于卵巢癌的诊断[6]、疗效监测[7]和预后判断等方面，不仅检测方便，而且无创。叶酸受体(FR)是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白，在健康人血液细胞中一般不表达，一旦发生上皮源性细胞癌变，FR表达量则显著上升，尤其是在卵巢癌、肺癌等上皮来源的肿瘤组织中[8]。本研究探讨叶酸受体阳性循环肿瘤细胞(FR+-CTC)在卵巢癌辅助诊断和治疗监测中的临床应用价值，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性选取武汉大学人民医院2019年5月—2020年12月诊治的31例卵巢癌患者纳入卵巢癌组，年龄21～76岁，平均(54.17±7.58)岁。纳入标准[9]: ① 经术后病理确诊卵巢癌，符合卵巢癌诊断标准者; ② 术前未接受放疗或化疗等抗肿瘤治疗者; ③ 治疗前后均检测FR+-CTC者; ④ 病例资料完整者。排除标准: 合并其他系统恶性肿瘤、重要脏器疾病者。同时选取59例在妇科门诊检测FR+-CTC的健康体检者纳入对照组，年龄20～84岁，平均(59.44±12.98)岁，均无肿瘤相关病史，无心、脑、肝等重要脏器器质性疾病。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器: FR+-CTC检测试剂盒(格诺思博生物科技有限公司), CA125检测试剂盒(Siments公司，批号015183), HE4检测试剂盒(瑞典康乃格公司，批号37356001), 罗氏cobas e 801全自动化学发光免疫分析仪，德国西门子ADVIA Centuar XP全自动化学发光免疫分析仪。

1.2.2 标本采集: 分别抽取卵巢癌患者(治疗前后)和对照组体检者静脉血4 mL于6 mL真空采血管(加有EDTA 抗凝剂)内，上下颠倒7～8次, 4～10 ℃暂存，并于24 h内进行检测。

1.2.3 FR+-CTC检测: 应用FR+-CTC检测试剂盒检测FR+-CTC水平。① 取全血标本3 mL置于15 mL离心管中，加入12 mL细胞裂解液裂解红细胞，离心10 min, 弃上清。② 加入重悬细胞后，加入免疫磁珠A液、B液负向富集去除样本中白细胞(CD45+)。③ 加入10 μL探针标记液，室温孵育40 min; 加入900 μL细胞洗涤液洗涤后，离心收集细胞。④ 行聚合酶链反应(PCR)扩增及荧光检测，计算各校准品CT值。参照多中心受试者临床试验结果，将每3 mL血中FR+-CTC≥8.7叶酸单位(FU)作为FR+-CTC阳性的判定标准。

1.2.4 CA125、HE4检测: 采用化学发光双抗体夹心法检测CA125、HE4水平，将CA125>30.2 U/mL作为CA125阳性的判定标准。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 不同临床特征卵巢癌患者的FR+-CTC检测结果

不同年龄、不同分期、不同组织分型、有无远处转移的卵巢癌患者FR+-CTC阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 不同临床特征卵巢癌患者的FR+-CTC检测结果比较[n(%)]

2.2 对照组与卵巢癌组外周血FR+-CTC含量比较

对照组体检者(n=59)外周血(3 mL) FR+-CTC含量为2.71～8.35 FU, 平均6.35(4.87, 7.44) FU; 卵巢癌组患者(n=31)治疗前外周血(3 mL)FR+-CTC含量为5.53～31.26 FU，平均11.78(7.36，17.31) FU; 卵巢癌组患者(n=24)治疗后外周血(3 mL) FR+-CTC含量为3.36～25.02 FU, 平均10.84(6.67, 20.95) FU。卵巢癌组患者治疗前后外周血FR+-CTC含量均高于对照组体检者，差异有统计学意义(P<0.05); 治疗后，卵巢癌组患者外周血FR+-CTC含量低于治疗前，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 FR+-CTC与CA125、HE4对卵巢癌的诊断结果比较

31例卵巢癌患者均检测FR+-CTC水平，且其中19例患者检测CA125水平, 21例患者检测HE4水平。外周血FR+-CTC诊断卵巢癌的灵敏度为87.10%, 高于血清肿瘤标志物CA125、HE4的灵敏度63.16%、52.38%, 差异有统计学意义(χ2=3.934、7.669,P=0.047、0.006), 故FR+-CTC可作为卵巢癌的早期独立预测因子，见表2。Pearson相关性分析结果显示, FR+-CTC与CA125、HE4均无相关性(r=0.280、0.384,P>0.05)。

表2 FR+-CTC与糖类抗原125、人附睾蛋白4对卵巢癌的诊断结果比较

2.4 FR+-CTC阳性、CA125阳性卵巢癌患者分期情况比较

FR+-CTC阳性(每3 mL外周血中FR+-CTC≥8.7 FU)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比70.37%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比， 差异有统计学意义(P<0.05); CA125阳性(CA125>30.2 U/mL)卵巢癌患者中, Ⅲ～Ⅳ期者占比91.67%, 高于Ⅰ～Ⅱ期者占比，差异有统计学意义(P<0.05);与CA125阳性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相比, FR+-CTC阳性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比更高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 FR+-CTC阳性、糖类抗原125阳性卵巢癌患者分期情况比较[n(%)]

3 讨 论

卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，病死率高居妇科恶性肿瘤的首位，严重危害女性生命安全与健康[10]。全球每年约有24万名女性被诊断出卵巢癌，整体5年生存率低于45%[11]。卵巢癌起病隐匿，早期缺乏明显症状，多数患者确诊时已发展至晚期[12]，出现腹水、腹胀、消瘦等症状，预后不良。早期诊断可提高卵巢癌患者的生存率，改善不良预后，但仅15%的卵巢癌患者能在早期确诊[13]。

CTC是指从恶性肿瘤原发部位或转移部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞[14], 可通过无创方式进行检测。目前, CTC已被广泛应用于肺癌[15]、乳腺癌[16]、结直肠癌[17]等恶性肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后判断中。虽然卵巢癌患者的CTC水平较其他实体瘤患者低，但近年来CTC也逐渐被应用于卵巢癌中，且有研究[18]指出CTC与卵巢癌治疗效果和预后具有相关性。KIM H等[19]检测了13例卵巢癌患者多个时点的血样，并评估CTC、CA125水平与疾病病程的相关性，发现手术、化疗后CTC计数下降，且CTC相较于CA125敏感性、阳性预测值更高，与治疗反应、复发的相关性更好。CHEBOUTI I等[20]对卵巢癌患者初诊及化疗后的配对血液样本的CTC水平和患者生存期进行分析后发现，化疗后CTC高水平与生存期缩短具有相关性。由此推测, CTC在卵巢癌患者疗效监测、预后判断方面具有重要的临床参考价值，但目前将FR+-CTC应用于卵巢癌早期辅助诊断的研究仍较少，故有必要进一步深入探讨。

李晓利等[21]分析CTC阳性率与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系发现, CTC阳性率与年龄、病理分型无相关性，但与淋巴结转移、国际妇产科联盟(FIGO)分期具有相关性。本研究结果显示，不同年龄、不同分期、不同组织分型、有无远处转移的卵巢癌患者FR+-CTC阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，与李晓利等[21]结论不符，这可能由FIGO分期、肿瘤远处转移的划分标准不同而引起。刘春华等[22]研究表明，卵巢癌患者组CTC检测阳性率为73.33%，与健康志愿者组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。本研究中，卵巢癌组患者治疗前后外周血FR+-CTC含量均高于对照组健康体检者，差异有统计学意义(P<0.05), 且对照组外周血FR+-CTC含量均低于阳性界定值，提示CTC检测结果能够辅助鉴别卵巢癌。BANYS-PALUCHOWSKI M等[23]分析卵巢癌患者化疗前和化疗3、6个周期后CTC水平发现，化疗3个周期后患者CTC阳性率下降至4.8%, 化疗6个周期后则未检出CTC阳性者。随着化疗周期的延长，卵巢癌患者CTC阳性率呈下降趋势，因此FR+-CTC能够反映患者的治疗效果，可用于卵巢癌的疗效监测。本研究结果显示，卵巢癌组患者治疗后的外周血FR+-CTC含量低于治疗前，但差异无统计学意义(P>0.05), 这可能与本研究样本量过少有关。

CA125是上皮细胞表达的糖蛋白[24], 在正常组织及良性病变组织中呈低表达，在卵巢癌中呈高表达，常被应用于卵巢癌的临床诊断和疗效监测。HE4是小分子分泌性蛋白[25], 在卵巢癌中呈高表达，可用于卵巢癌的复发诊断与预测。相关研究[26]报道, HE4联合CA125预测卵巢癌复发的灵敏度、特异度均高于单独应用HE4。PEARL M L等[27]研究发现，对于Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌而言，CTC诊断的特异度与阳性预测值均高于CA125，且CTC与临床因素的一致性强于CA125。ZHANG X H等[28]检测14例早期(ⅠA～ⅠB期)卵巢癌患者的CTC、CA125水平发现, CTC诊断早期卵巢癌的效果相较于CA125更突出。本研究发现, FR+-CTC诊断卵巢癌的灵敏度为87.10%, 显著高于CA125、HE4的诊断灵敏度63.16%、52.38%。刘春华等[22]对78例卵巢癌患者进行CTC与CA125检测后发现，随着化疗周期的延长，患者CTC、CA125水平均呈下降趋势，但CTC与CA125水平变化无相关性。本研究结果显示, FR+-CTC可作为卵巢癌的独立预测因子，但FR+-CTC与CA125、HE4无显著相关性。相关研究[29]报道，卵巢癌晚期患者的平均CTC计数高于卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期患者。本研究还发现，相较于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者, Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者中更易检出FR+-CTC阳性、CA125阳性，且FR+-CTC阳性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相较于CA125阳性患者中更高，即CTC比CA125更灵敏，可辅助诊断早期卵巢癌。

综上所述，卵巢癌患者外周血FR+-CTC含量较健康人显著升高，治疗后外周血FR+-CTC含量较治疗前有所下降，且FR+-CTC阳性患者中Ⅰ～Ⅱ期者占比相较于CA125阳性患者中更高，表明FR+-CTC可用于卵巢癌的早期辅助诊断和疗效监测，为卵巢癌的早诊断、早治疗提供参考依据，进而改善卵巢癌患者的预后。此外, CA125、HE4对卵巢癌具有良好的诊断价值，故推测FR+-CTC联合CA125、HE4检测可进一步提高卵巢癌的早期检出率，但未来还需开展大量研究加以证实。