环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3促进三阴乳腺癌细胞增殖和迁移的作用机制研究

丛 佳, 石 杨, 刘远远

[辽宁省大连市妇女儿童医疗中心(集团), 1. 乳腺科, 2. 生殖实验室, 3. 病理科, 辽宁 大连, 116033]

三阴乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌发病率的15%～20%, 为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(HER-2)均阴性的乳腺癌类型[1]。因其特殊的分子表型, TNBC对内分泌治疗和分子靶向治疗不敏感，目前主要的治疗方式为手术局部切除和全身化疗，但常规术后辅助放化疗的疗效较差，肿瘤转移率和复发率均较高，故TNBC已成为最具有治疗挑战性的乳腺癌亚型[2]。环状RNA(circRNA)是于1970年被发现的一类非编码RNA, 其没有5′帽子结构和多聚腺苷酸尾，具有稳定的共价闭环结构，在不同组织和不同发育阶段均有表达且发挥着重要的生物学作用[3]。研究[4]显示, circRNA在人类恶性肿瘤的发生与发展中具有关键调控作用。circRNA同源域相互作用蛋白激酶3(circHIPK3)位于染色体区域11p13上，属致癌因子，可促进胃癌、肾细胞癌和肺癌等多种肿瘤的恶性进展，并调控细胞增殖、迁移、耐药、自噬和凋亡等肿瘤生物学行为[5-7]。CHEN Z G等[8]报道, circHIPK3在乳腺癌组织中表达上调，并促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，是乳腺癌治疗的新型分子靶点，但circHIPK3在预后更差的TNBC中发挥的作用未知。本研究探讨circHIPK3在TNBC中发挥的作用及其分子机制，以期为研究circHIPK3能否作为TNBC的潜在治疗分子靶点提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TNBC细胞系HCC1806、MDA-MB-231、HCC-70和人正常乳腺细胞系MCF-10A购自美国ATCC细胞库; RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰酶和青链霉素混合液购自美国Hyclone公司; Trizol试剂购自美国Invitrogen公司; RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司; 聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自德国QIAGEN公司; circHIPK3敲减质粒和circHIPK3过表达质粒购自广州锐博生物技术有限公司; 细胞增殖实验(MTS)试剂盒购自美国Biovision公司; Transwell小室购自美国Coring公司; 吉姆萨染色液购自上海碧云天生物有限公司; RIPA裂解液购自北京索莱宝试剂有限公司; BCA蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司; 聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增强型化学发光法(ECL)发光液(100 mL)购自美国Millipore公司; Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、原癌基因c-MYC、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 将TNBC细胞系HCC1806、MDA-MB-231、HCC-70和人正常乳腺细胞系MCF-10A从液氮中取出立即放置于37 ℃水浴锅中，解冻后800转/min离心5 min, 去除冻存液后加入RPMI 1640细胞培养基，并加入10%的胎牛血清和5%的青链霉素混合液，放置于含5%CO2的37 ℃全湿度细胞孵育箱中培养。每隔1 d更换1次培养基，采用胰酶消化法进行细胞传代。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测circHIPK3表达: 胰酶消化后收集待检测细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后加入TRIzol试剂裂解细胞。采用RNA提取试剂盒提取裂解细胞中的总RNA。检测RNA的纯度及浓度后，采用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒配制反应体系进行qRT-PCR扩增。配制反应试剂, 5× QIAGEN一步法RT-PCR缓冲液10 μL、dNTP混合物2 μL、QIAGEN一步法RT-PCR酶混合物2 μL、上下游引物各1 μL、RNA 1 μg, 加无RNA酶水补足至50 μL。反应条件为逆转录50 ℃ 30 min、预变性95 ℃ 15 min, 变性94 ℃ 30 s, 退火56 ℃ 60 s, 延伸72 ℃ 60 s, 变性、退火、延伸设置40个循环，终延伸72 ℃ 10 min。每个circHIPK3检测样品设置3个平行样，根据内参基因GAPDH将数据进行归一化，采用2-△△Ct公式计算circHIPK3的相对表达水平。circHIPK3引物序列为5′-TATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCA-3′(正向)和5′-TGGTGGGTAGACCAAGACTTGTGA-3′(反向),GAPDH引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(正向)和5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5′(反向)。

1.2.3 细胞转染: 选择生长状态较好的MDA-MB-231细胞和HCC-70细胞，用胰酶消化后进行细胞计数，按1×105个细胞/孔接种至6孔板中。将MDA-MB-231细胞分为sh-NC组和sh-circHIPK3组，将HCC-70细胞分为oe-NC组和oe-circHIPK3组。采用Lip2000对各组细胞进行转染, sh-NC组细胞转染NC敲减质粒, sh-circHIPK3组细胞转染circHIPK3敲减质粒, oe-NC组细胞转染NC过表达质粒, oe-circHIPK3组转染circHIPK3过表达质粒。将各组细胞置于含5%CO2的37 ℃全湿度细胞孵育箱中培养。转染48 h后，采用qRT-PCR法检测各组细胞中circHIPK3表达量，观察circHIPK3敲减质粒、circHIPK3过表达质粒的转染效果。

1.2.4 MTS检测细胞增殖活性: 转染各组细胞，胰酶消化后进行细胞计数，按1 500个细胞/孔接种至96孔板中，每组设置6个平行样，并设置0、24、48、72 h共4个时点，将细胞放置在含有5%CO2的37 ℃全湿度细胞孵育箱中培养。在不同时点，将每个样品更换100 μL的新鲜培养基，并加入20 μL的MTS检测试剂，于细胞孵育箱中继续培养2 h后，采用酶标仪检测各样品在490 nm处的光密度(OD)值, OD值越大表示细胞增殖活性越强。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移: 转染各组细胞，胰酶消化，以无血清培养基洗3次后进行细胞计数，采用无血清培养基调整细胞浓度至1×106个/mL, 吸取100 μL细胞悬液至Transwell小室的上室膜中，将Transwell小室的上室放至含500 μL 10%血清培养基的Transwell小室的下室，每组设置3个平行样，放置于含5%CO2的37 ℃全湿度细胞孵育箱中培养。培养12 h后，将Transwell小室的上室膜用PBS洗3次后放入甲醇中固定10 min，于吉姆萨染色液中染色20 min。PBS洗3次后，于显微镜下计数各组细胞穿膜数目。

1.2.6 TOP/FOP Flash双荧光素酶活性检测: 转染各组细胞，胰酶消化后进行细胞计数，按1 500个细胞/孔接种至96孔板中，每组设置6个平行样，将TOP Flash质粒、FOP Flash质粒分别转染到各组细胞中，放置于含5%CO2的37 ℃全湿度细胞孵育箱中培养。共转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.2.7 蛋白质印迹法(Western blotting)检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达: 胰酶消化后，收集待检测细胞，用PBS洗3次后加入蛋白裂解液裂解细胞。将细胞裂解液4 ℃高速离心30 min去除细胞碎片后，收集蛋白裂解液，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)检测蛋白浓度。于蛋白裂解液中加入上样缓冲液，煮沸3 min使蛋白变性。将蛋白样品加至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，采用80 V电压电泳100 min分离蛋白，采用100 V电压湿转120 min转移蛋白至PVDF膜上。将PVDF膜与封闭液常温孵育1 h后，用TBST洗3次，加入待检测蛋白一抗稀释液(Wnt3a、β-catenin、c-MYC、MMP-2一抗稀释液的稀释比例均为1∶500, GAPDH一抗稀释液为1∶500)于4 ℃孵育过夜, TBST洗3次，加入相对应的兔、鼠二抗稀释液(1∶8 000)室温孵育1 h, 用ECL试剂盒显示蛋白条带。采用ImageJ软件分析蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 circHIPK3在不同细胞系中的表达水平

circHIPK3在TNBC细胞系HCC1806、MDA-MB-231、HCC-70中的相对表达量分别为(4.06±0.81)、(5.78±0.56)、(2.33±0.84), 在人正常乳腺细胞系MCF-10A中的相对表达量为(1.06±0.10)。与正常乳腺细胞系MCF-10A相比, circHIPK3在3种TNBC细胞中的表达水平均升高，差异有统计学意义(F=30.110,P<0.001)。3种TNBC细胞中, MDA-MB-231细胞circHIPK3表达水平最高, HCC-70细胞表达水平最低，与HCC1806细胞比较，差异有统计学意义(t=3.025、2.568,P=0.029、0.048)。见图1。

与MCF-10A细胞比较, **P<0.001。图1 circHIPK3在TNBC细胞系和人正常乳腺细胞系中的表达

2.2 circHIPK3敲减质粒、过表达质粒的转染效果

选择circHIPK3表达量最高的TNBC细胞系MDA-MB-231进行circHIPK3 敲减质粒转染实验, qRT-PCR结果显示, circHIPK3在sh-circHIPK3组中的相对表达量为(0.36±0.06), 低于sh-NC组的(0.98±0.03), 差异有统计学意义(t=16.008,P<0.001), 见图2A。选择circHIPK3表达量最低的 TNBC细胞系HCC-70进行circHIPK3 过表达质粒转染实验, qRT-PCR结果显示, circHIPK3在oe-circHIPK3组中的相对表达量为(6.29±0.71), 高于oe-NC组的(0.99±0.05), 差异有统计学意义(t=12.897,P<0.001), 见图2B。

A: circHIPK3敲减质粒对MDA-MB-231细胞的转染效果(与sh-NC组比较, **P<0.001);B: circHIPK3过表达质粒对HCC-70细胞的转染效果(与oe-NC组比较, **P<0.001)。图2 circHIPK3敲减质粒、过表达质粒对TNBC细胞系的转染效果

2.3 circHIPK3对TNBC细胞增殖活性的影响

MTS结果显示，与sh-NC组相比, sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞24、48、72 h时的增殖活性降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与oe-NC组相比, oe-circHIPK3组HCC-70细胞24、48、72 h时的增殖活性增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表1。

A: 敲减circHIPK3表达对MDA-MB-231细胞增殖活性的影响(与sh-NC组比较, *P<0.05);B: 过表达circHIPK3对HCC-70细胞增殖活性的影响(与oe-NC组比较, *P<0.05)。图3 circHIPK3对TNBC细胞增殖活性的影响

表1 各组细胞不同时点的光密度值比较

2.4 circHIPK3对TNBC细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示, sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞穿膜细胞数目为(14.67±7.08)个，少于sh-NC组的(35.33±9.25)个，差异有统计学意义(t=4.344,P=0.001), 即sh-circHIPK3组细胞迁移能力降低，见图4A。oe-circHIPK3组HCC-70细胞穿膜细胞数目为(82.33±11.51)个，多于oe-NC组的(30.67±10.32)个，差异有统计学意义(t=8.186,P<0.001), 即oe-circHIPK3组HCC-70细胞迁移能力提高，见图4B。

A: 敲减circHIPK3表达对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响; B: 过表达circHIPK3对HCC-70细胞迁移能力的影响。图4 各组TNBC细胞迁移能力的Transwell实验结果(吉姆萨染色,放大200倍)

2.5 circHIPK3对TNBC细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响

TOP/FOP Flash双荧光素酶活性检测结果显示, sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞荧光素酶相对活性为(0.56±0.08), 低于sh-NC组的(1.00±0.05), 差异有统计学意义(t=11.424,P<0.001), 即sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路活性降低，见图5A; oe-circHIPK3组HCC-70细胞荧光素酶相对活性为(3.83±0.55), 高于oe-NC组的(1.00±0.04), 差异有统计学意义(t=12.571,P<0.001), 即oe-circHIPK3组HCC-70细胞Wnt/β-catenin信号通路活性增加，见图5B。

A: 敲减circHIPK3表达对MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响(与sh-NC组比较, **P<0.001);B: 过表达circHIPK3对HCC-70细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响(与oe-NC组比较, **P<0.001)。图5 circHIPK3对TNBC细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响

2.6 circHIPK3对TNBC细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

Western blotting实验结果显示，与sh-NC组比较, sh-circHIPK3组MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、c-MYC、MMP-2表达降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与oe-NC组比较, oe-circHIPK3组HCC-70细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、c-MYC、MMP-2表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6、表2。

A: 敲减circHIPK3表达对MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响;B: 过表达circHIPK3对HCC-70细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的影响。图6 circHIPK3对TNBC细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

表2 各组细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达情况

3 讨 论

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈现持续上升趋势。根据ER、PR、增殖指数Ki-67和HER-2等分子特征，乳腺癌可分为Lumina A、Lumina B、HER-2过表达和基底样癌等不同类型，与ER阳性、PR阳性和HER2阳性的乳腺癌相比, TNBC具有发病年龄较早、侵袭性强和预后不良的特性[2]。与其他亚型乳腺癌不同的是, TNBC仍然缺乏有效的分子靶向治疗方法，但热疗、光动力疗法以及基于纳米医学、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和适体的靶向治疗等一系列新型疗法增加了TNBC患者的治疗机会[9]。TNBC的发病机制目前尚未完全阐明，研究TNBC恶性进展过程中发挥重要作用的分子，对于探索更有效的分子靶点进而改善TNBC患者的生存质量至关重要。

circRNA属于非编码RNA, 密切参与增殖、侵袭和迁移等肿瘤病理过程[3-4]。circHIPK3又名hsa_circ_0000284, 由HIPK3基因的第2个大外显子(1 099 nt)组成(HIPK3基因是酵母基因YAK1的人类蛋白激酶同源物，从多药耐药细胞系KB-V1中克隆), circHIPK3主要定位于细胞质中，广泛表达于各个组织内，其中大脑和小脑中的表达最为丰富[10]。相关研究[11]发现, circHIPK3在多种肿瘤的发生和发展中发挥着至关重要的作用，并且可能成为一种有潜力的肿瘤诊断生物标志物或治疗靶点。circHIPK3在胃癌组织和细胞系中的表达显著上调，并与胃癌患者的总生存率呈负相关，沉默circHIPK3的表达可减弱胃癌细胞的增殖和迁移能力[5]。circHIPK3在肾细胞癌组织和细胞中过表达，敲减circHIPK3能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[6]。CHEN Z G等[8]报道，乳腺癌组织中circHIPK3表达上调预示乳腺癌患者预后较差, circHIPK3在体内和体外均可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。为了明确circHIPK3是否在TNBC中发挥重要功能，本研究检测了circHIPK3在TNBC细胞系中的表达水平，发现circHIPK3在3种TNBC细胞系中的表达水平均显著高于人正常乳腺细胞系MCF-10A, 提示circHIPK3在TNBC中同样发挥促癌作用。本研究选用circHIPK3高表达的TNBC细胞系MDA-MB-231转染circHIPK3敲减质粒，选用circHIPK3低表达的TNBC细胞系HCC-70转染circHIPK3过表达质粒，发现敲减circHIPK3表达可抑制TNBC细胞的增殖和迁移能力，过表达circHIPK3可促进TNBC细胞的增殖和迁移能力，表明circHIPK3在TNBC的恶性进展中发挥促癌作用，与其他肿瘤疾病研究[5-7]中circHIPK3的作用一致。

既往研究[7]显示, circHIPK3在肺癌中可以通过激活蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)信号通路促进肺癌进展; circHIPK3在食管鳞癌细胞中通过调控p53-Akt-Mdm2信号通路促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡[12]; circCHIPK3过表达通过调控HMGB1/PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞恶性进展[8]; circHIPK3通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖与转移[5]。由此提示, AKT/mTOR、p53-Akt-Mdm2、PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路均密切参与肿瘤增殖、迁移等恶性生物学行为。Wnt/β-catenin在TNBC中处于激活状态，失活后可抑制TNBC细胞恶性行为，可作为TNBC治疗的潜在靶点[13]。本研究采用TOP/FOP Flash双荧光素酶报告基因检测circHIPK3对TNBC细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性的影响，发现敲减circHIPK3表达会降低Wnt/β-catenin信号通路活性，而过表达circHIPK3会增强Wnt/β-catenin信号通路活性。Wnt/β-catenin信号通路激活的经典途径为在Wnt配体的存在下促使β-catenin积累并入核, β-catenin入核后激活其下游靶基因的表达[14]。作为Wnt配体之一, Wnt3a在TNBC中高表达，参与Wnt/β-catenin信号通路促进TNBC的进展[15]。相关研究[16]显示, Wnt/β-catenin下游靶基因增殖相关蛋白c-MYC和迁移相关蛋白MMP-2同样在TNBC中发挥促癌作用。本研究Western blotting检测结果显示，敲减circHIPK3表达会抑制TNBC细胞中Wnt3a、β-catenin、c-MYC和MMP-2蛋白的表达，过表达circHIPK3会促进Wnt3a、β-catenin、c-MYC和MMP-2蛋白的表达。由此表明，circHIPK3通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进TNBC细胞的增殖与迁移。

综上所述, circHIPK3在TNBC细胞系中表达上调，通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进TNBC细胞增殖和迁移，故circHIPK3可能是TNBC治疗的潜在分子靶点。