姜黄素对PM2.5致大鼠急性肺损伤的影响

劳文艳，杨秦亮，范子轩，任 超

(1.北京联合大学 生物化学工程学院,北京 100023.金诃藏药(山东)健康产业有限公司,济南 2501043 北京联合大学 应用文理学院保健食品功能检测中心,北京 100191)

随着空气污染的加重，PM2.5已经严重危害人类健康。近年来，多地大气PM2.5浓度达到历史峰值[1]。流行病学研究表明，PM2.5可影响人体呼吸系统、心血管系统和神经系统等多个系统，其中以呼吸系统毒性最为明显[2-3]。姜黄素具有抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性[4]，诸多研究证明其在肺功能改善方面具有明显功效，例如，姜黄素可改善脓毒症大鼠的肺损伤，调节免疫功能，降低炎症反应[5]。姜黄素可改善肺炎链球菌致肺炎幼鼠肺组织的损伤，减轻炎症反应[6]。关于姜黄素能否有效干预PM2.5造成的肺损伤，国内研究较少。本研究通过PM2.5气管滴注染毒制备大鼠急性肺损伤模型，并用姜黄素进行干预处理，探索姜黄素对大鼠肺部氧化应激水平、炎性因子等的影响，为姜黄素在干预PM2.5肺损伤功能方面的应用提供研究依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选用体重为180～220 g的SPF级健康SD雄鼠50 只，实验动物质量合格证为110322210100996787，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0008(动物批号20210422)。在北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心屏障级动物房饲养，动物使用许可证号为SYXK(京)2014-0031。

1.1.2材料与试剂

姜黄素(宁波中药制药股份有限公司)，白细胞介素-1β酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，乳酸脱氢酶试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)，丙二醛试剂盒(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，酸性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3仪器

大流量空气颗粒物采样器(中国，天虹), 多功能酶标仪(美国，Thermo)，UV2600紫外可见分光光度计(日本，岛津)，生化分析仪(美国，BECKMAN)，MK360石英滤膜(瑞典，Munktell)，病理制片系统(德国，Leica)，冷冻离心机(德国，Sigma)。

1.2 方法

1.2.1PM2.5的收集和染毒悬液的制备

通过大容量空气颗粒物采样器(配PM2.5切割器)和石英滤膜采集大气细颗粒物，流量为1.05 m3·min-1，采集时间为2020年10月至2021年2月，每日连续采集22 h，间隔2 h。采集完成后将石英膜剪切成1 cm×3 cm，低温超声振荡6次，每次超声25 min，洗脱颗粒物，振荡液经8层纱布过滤，真空冷冻干燥成粉，用无菌生理盐水配制成PM2.5悬液。

1.2.2实验分组与染毒

将50只SD大鼠随机分为5组：空白对照组、PM2.5模型对照组、低剂量姜黄素(100 mg·kg-1)+PM2.5组、中剂量姜黄素(200 mg·kg-1)+PM2.5组、高剂量姜黄素(300 mg·kg-1)+PM2.5组，每组10只。

低、中、高3个剂量的姜黄素 + PM2.5组于染毒前连续用营养素溶液灌胃14 d，空白组和PM2.5模型组用无菌生理盐水灌胃，灌胃时间为上午9点，灌胃容量均为10 mL·kg-1。于灌胃第15 d开始，在灌胃后2 h内用4%戊巴比妥钠麻醉大鼠，按3 mL·kg-1容量进行气管滴注，PM2.5模型组和姜黄素+PM2.5组按9.0 mL·kg-1气管滴注PM2.5悬液，连续染毒3次，每次间隔24 h；空白组气管滴注无菌生理盐水。

1.2.3动物处理、样本采集及测定各样本指标

1) 血清

在末次染毒24 h后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，股动脉取血，离心分离血液上清液，检测MDA和SOD水平。

2) 肺泡灌洗液

在处死大鼠后，以止血钳夹闭左主支气管，往气管中插入肺灌洗针头，结扎固定。向肺部缓慢注入3 mL冷磷酸缓冲液，轻按揉肺部，缓慢抽出灌洗液，反复操作3次。将肺泡灌洗液经2次离心取上清，检测LDH、ACP和AKP水平。

3) 肺组织匀浆

称取未经灌洗的肺叶约0.3 g，剪碎后加入冰无菌生理盐水，低温下充分匀浆，离心后取上清液测量TNF-α和IL-1β水平。

4) 肺组织病理学观察

取未经灌洗部分的肺叶，经固定，取中段肺组织进行切片，苏木精—伊红(HE)染色，盲法阅片，光镜下观察肺组织的病理学改变。

以上涉及试剂盒的操作均严格按照试剂盒说明书执行。

1.3 统计分析

数据采用SPSS 20.0软件进行分析，计量资料以±s表示。均数比较采用单因素方差分析；组间均数两两比较采用LSD-t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对PM2.5致肺损伤大鼠肺毒性指标的影响

与空白对照组比较，PM2.5模型组BALF中的AKP、ACP和LDH水平显著提高(P< 0.01)。与PM2.5模型组比较，中、高剂量姜黄素 + PM2.5组BALF中的AKP、ACP和LDH水平降低(P< 0.01)，低剂量姜黄素 + PM2.5组BALF中的ACP和LDH水平降低(P< 0.05，P< 0.01)。低剂量姜黄素 + PM2.5组BALF中的AKP水平差异无统计学意义(P> 0.05)(见表1)。由此可见，中高剂量组的姜黄素能有效降低PM2.5滴注引起的大鼠肺损伤的肺毒性指标。

表1 姜黄素对大鼠BALF中LDH、ACP和AKP含量水平的影响Table 1 Effects of Curcumin on the Levels of LDH, ACP and AKP in BALF of Rats

2.2 姜黄素对PM2.5致肺损伤大鼠炎性损伤指标的影响

与空白对照组比较，PM2.5模型组大鼠肺匀浆中的TNF-α和IL-1β含量均显著升高(P<0.01)。与PM2.5模型组比较，低、中、高3个剂量姜黄素+PM2.5组的TNF-α和IL-1β含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，见表2。由此说明，通过姜黄素的干预，能有效降低大鼠肺匀浆中TNF-α和IL-1β的含量。

表2 姜黄素对大鼠肺匀浆中TNF-α和IL-1β含量水平的影响Table 2 The Effect of Curcumin on the Content of TNF-α and IL-1β in Rat Lung Homogenate

2.3 姜黄素对PM2.5致肺损伤大鼠氧化应激损伤指标的影响

与空白对照组相比，PM2.5模型对照组大鼠血清中的MDA值与SOD活性值差异显著(P<0.05)，MDA值升高，SOD活力降低。与PM2.5模型组相比，中、高剂量姜黄素 + PM2.5组的MDA值均降低(P< 0.05)，SOD活性水平均升高(P< 0.01)。低剂量姜黄素 + PM2.5组的SOD活性水平均升高(P< 0.05)，MDA值降低但无统计学意义(P>0.05)(见表3)。由此说明，中、高剂量组的姜黄素能够有效干预PM2.5造成的大鼠肺损伤的氧化应激指标，低剂量组的姜黄素也能部分改善大鼠肺损伤的氧化应激指标。

表3 姜黄素对大鼠血清中MDA和SOD活性水平的影响Table 3 The Effect of Curcumin on the Activity Levels of MDA and SOD in Rat Serum

2.4 肺组织形态学改变

各组大鼠肺组织病理形态如图1所示。空白对照组：肺泡结构完整，肺泡间隔正常，未见出血和炎性浸润。PM2.5模型组：肺泡结构破坏严重，肺泡间隔增厚，可见大量坏死组织碎片、出血、炎性细胞和细颗粒物。低剂量姜黄素+PM2.5组：肺泡间隔较厚，小部分肺泡结构可以识别，可见少量坏死组织碎片、炎性细胞和细颗粒物。中剂量姜黄素+ PM2.5组：肺泡间隔轻微增厚，肺泡结构可以识别，未见脱落的组织碎片，少量炎性细胞浸润。高剂量姜黄素+ PM2.5组：肺泡间隔轻微增厚，肺泡结构较清晰，未见脱落的组织碎片，偶见少量炎性细胞浸润。由此可见，姜黄素对PM2.5滴注造成的肺损伤有一定的保护作用，实验过程的3个剂量随着浓度的升高病理图片改善效果显著。

图1 各组大鼠肺组织病理变化(HE染色，200×)Fig.1 The Effect of Curcumin on the Activity Levels of MDA and SOD in Rat Serum (±SD)注: 对照组(图1A)、PM2.5模型组(图1B)、姜黄素低剂量组(图1C)、姜黄素中剂量组(图1D)、姜黄素高剂量组(图1E)

3 讨论

多项研究表明，PM2.5滴注造成急性肺损伤的核心机制是氧化应激和炎性损伤[7]。PM2.5能刺激细胞产生大量活性氧，蓄积的活性氧会干扰SOD的表达并引起脂质过氧化代谢终产物MDA的增加[8]，从而引起DNA氧化损伤。本研究发现，与空白对照组相比，PM2.5模型组中血清SOD的活力降低，MDA的含量增加，说明气管滴注PM2.5成功引起了大鼠肺部急性氧化应激损伤。姜黄素干预后，大鼠SOD的活力升高，MDA的含量降低，说明姜黄素能抗氧化并减轻PM2.5导致的氧化损伤。

IL-1β和TNF-α是机体早期炎性反应的敏感指标[9]。PM2.5破坏呼吸系统气道粘膜纤毛屏障，沉积并刺激血管内皮细胞、支气管和肺泡上皮细胞，巨噬细胞释放大量炎性因子，如TNF-α和IL-1β[10]。PM2.5造成肺部实质性细胞膜损伤从而改变肺的通透性，ACP、AKP和LDH会大量溢出细胞外，这3个指标是细胞膜损伤的早期敏感指标，是细胞毒性标志物[11]。本研究发现，与空白对照组相比，PM2.5模型组大鼠肺匀浆中的TNF-α和IL-1β以及BALF中的ACP、AKP和LDH水平均升高，表明PM2.5具有引起大鼠急性肺部炎症及毒性作用。经姜黄素干预后，各剂量组的 TNF-α和IL-1β含量均降低，中、高剂量姜黄素组中的ACP、AKP和LDH水平均降低。低剂量姜黄素组中的ACP和LDH差异显著，AKP差异不显著。此结果显示，减轻PM2.5所致急性肺部炎性损伤的效果与剂量有关，中、高剂量姜黄素的效果更显著。肺病理形态学结果同样显示，高剂量姜黄素干预对PM2.5诱发的肺泡间隔增厚、肺泡结构破损和炎性细胞浸润等有减轻作用。

实验结果表明，一定剂量的姜黄素可以通过减轻氧化应激和炎性损伤，对PM2.5所致的大鼠肺损伤具有一定的保护作用。