参芪扶正汤对盆腔炎性疾病后遗症小鼠上生殖道炎症及粘连相关因子的影响

王 阳，边玉培，卜晓玲

(1. 北京中医药大学，北京 100029;2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

盆腔炎性疾病指女性上生殖道感染性疾病，若未能及时、彻底治疗可能会发生盆腔炎性疾病后遗症,主要病理改变为广泛组织破坏、粘连、增生及瘢痕形成，导致不孕、异位妊娠、反复发作的慢性盆腔痛等[1]，严重危害女性身心健康。盆腔炎性疾病后遗症引起的慢性盆腔痛常由粘连、瘢痕形成以及盆腔充血导致，目前尚无有效的治疗方法[2]，西医主要给予非甾体抗炎药对症处理，但长期反复使用对机体有明显的不良影响,并易产生耐药性[3]。中医药治疗盆腔炎性疾病后遗症具有一定优势，属于中医优势病种[4-5]。参芪扶正汤是北京中医药大学东方医院治疗盆腔炎性疾病后遗症的经验方，口服及保留灌肠均有一定疗效，但其作用机制尚不明确。本实验以盆腔炎性疾病后遗症的主要病理改变即盆腔粘连为切入点，通过观察小鼠上生殖道中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1( TGF-β1)、I型胶原蛋白(collagen I)表达情况，探讨了参芪扶正汤治疗盆腔炎性疾病后遗症的机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康7～8周龄雌性BALB/c小鼠60只，体重(20±1)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号:SCXK(京)2016-0011。SPF级动物环境，自由摄食及饮水。实验方案经北京中医药大学动物实验伦理委员会批准(BUCM-4-20180312011-1017)。

1.2实验药物 参芪扶正汤(丹参10 g、黄芪15 g、党参15 g、当归10 g、白术15 g、赤芍10 g、鸡血藤10 g、桑枝10 g、延胡索9 g)颗粒剂，加10倍蒸馏水充分稀释，常压浓缩调整至浓度为0.85 g生药/mL的溶液，中药购于北京中医药大学东方医院药房，由北京康仁堂有限公司提供。阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司，国药准字J20171021，规格：100 mg/片)，溶于0.5%羧甲基纤维素钠中，配置成浓度为10 mg/mL的阿司匹林溶液。所有溶液均密封，置于4 ℃冰箱备用。

1.3实验试剂 浓盐酸(国药集团化学制剂有限公司，批号：20180306)，脂多糖(LPS，美国Sigma公司，批号：12190801), 孕马血清促性腺激素(PMSG,宁波第二激素厂，批号：190723), GAPDH一抗(美国bioworld公司，AP0063)，TNF-α一抗(美国Abcam公司，ab183218)、TGF-β1一抗(美国Abcam公司，ab215715)、collagen I一抗(美国CST公司，#72026)，二抗(美国KPL公司，074-1506)。

1.4实验仪器 高速离心机(德国Eppendorf公司)，紫外分光光度计(德国赛默飞世尔科技有限公司)，电泳槽、转移槽、电泳仪(中国北京六一仪器厂)。

1.5实验方法 将60只小鼠随机分为6组，每组10只。适应性喂养10 d后，除空白组外，其余组小鼠参考文献[6]方法造模。具体方法：造模日前2 d，每只小鼠皮下注射PMSG 7.5 IU，1次/d，共2 d；空白组皮下注射0.9%氯化钠溶液。造模日，除空白组小鼠宫颈内注射0.9%氯化钠溶液外，其余组小鼠均宫颈内注射盐酸25 mg/kg。注射完毕2 h后，空白组小鼠宫颈内注射0.9%氯化钠溶液，其余组小鼠均宫颈内注射LPS 50 mg/kg，每2 h 1次，共4次。最后一次宫颈注射LPS 10 h后对小鼠进行脸谱疼痛(MGS)评估[7]：单手固定小鼠使其悬空仰伸，取两侧髂前上棘的连线做3等分，在2个等分点上用棉签深压腹部，若小鼠面部表情出现变化或挣扎，同时伴有安静状态下弓背、炸毛、闭眼、反应能力下降中任意一项，同时眼眶取血检测白细胞数目升高，则判定造模成功。造模成功后继续喂养6周，形成盆腔炎性疾病后遗症小鼠模型后，阿司匹林组予阿司匹林肠溶片溶液灌胃，参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组分别予参芪扶正汤灌胃、灌肠，参芪扶正汤灌胃灌肠组给予参芪扶正汤灌胃及参芪扶正汤灌肠，空白组及模型组予等体积等浓度羧甲基纤维素钠灌胃。小鼠药物用量根据成人服用剂量，按照千克体重剂量换算公式Db=Da·(Kb/Ka)·(Wa/Wb)1/3进行计算[8]，小鼠等剂量的给药量约为成人用药量的6倍，故阿司匹林肠溶片用药量为0.2 mg/(g·d)、参芪扶正汤用药量为17 mg/(g·d),每周称重1次，调整给药量。各组均连续干预3个动情周期(每个动情周期4～5 d)。

1.6观察指标及方法

1.6.1MGS评分 各组小鼠均于最后一次干预后第2天，由实验人员实施盲法评估，观察小鼠面部表情(眼眶收紧、耸鼻尖、鼓起两腮、耳朵位置、胡须摆动)，面部表情无变化为0分，有轻微面部表情变化为1分，有明显面部表情变化为2分，取两侧评分相加后的总分[9]。

1.6.2上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I表达情况 最后一次干预后，小鼠饥饿12 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.33 mL/100 g)麻醉小鼠，常规消毒腹部皮肤，打开腹腔，快速进行上生殖道(子宫、输卵管、卵巢)取材。将同一只小鼠的子宫、输卵管、卵巢置于同一冻存管内，迅速移入-80 ℃液氮冻存。每组随机选取3个样本，Western blot法重复检测3次：将小鼠上生殖道组织加液氮进行匀浆，加入1 mL PBS，500×g离心5 min，吸干PBS，加入5倍体积裂解液，混匀，冰浴中以最大超声波击碎细胞。4 ℃下12 000 r/min离心(离心半径9.0 cm)15 min收集取上清。BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。以GAPDH作为上样量内参，将30 μg样品上样进行SDS-PAGE电泳,分离后的蛋白60 V恒压60 min转移至硝酸纤维素膜。封闭液室温封闭1 h，加入1∶1 000稀释的一抗4 ℃过夜，再置于二抗稀释液中室温孵育2 h，采用DAB显色和ECL曝光，并用Lab Works软件进行灰度分析。蛋白相对表达量以TNF-α、TGF-β1、collagen I与GAPDH光密度比值表示。

2 结 果

2.1各组小鼠MGS评分比较 空白组、模型组、阿司匹林组、参芪扶正汤灌胃组、参芪扶正汤灌肠组、参芪扶正汤灌胃灌肠组小鼠MGS评分分别为(1.30±0.95)分、(3.70±2.0)分、(3.50±1.18)分、(3.10±1.00)分、(2.50±0.85)分、(2.40±0.97)分，模型组小鼠MGS评分明显高于空白组(P<0.05)，各药物组小鼠MGS评分均明显低于模型组(P均<0.05)，参芪扶正汤各组MGS评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2各组小鼠上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量比较 模型组小鼠上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)。参芪扶正汤各组小鼠上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，但参芪扶正汤各组间TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；阿司匹林组小鼠上生殖道组织中仅TNF-α相对表达量明显低于模型组(P<0.05)，TGF-β1、collagen I相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表1。

A为空白组；B 为模型组；C 为阿司匹林组；D为参芪扶正汤灌胃组； E为参芪扶正汤灌肠组； F为参芪扶正汤灌胃灌肠组图1 空白组和盆腔炎性疾病各组小鼠上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I表达情况

表1 空白组和盆腔炎性疾病后遗症各组小鼠上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量比较

3 讨 论

盆腔炎性疾病后遗症属中医“妇人腹痛”“带下病”“月经病”“不孕症”等范畴，多由湿热邪毒未尽，客于冲任胞宫所致。因余邪留恋，阻滞冲任胞宫胞脉，气血运行受阻，日久成瘀。病情反复，正邪交争，耗损正气，日久必虚。因此，盆腔炎性疾病后遗症以“虚”“瘀”为基本特征，可兼有肝郁、湿热、寒湿，是虚实夹杂、寒热错综之证，治宜扶正化瘀。在金哲教授经验方丹枝饮基础上，课题组结合盆腔炎性疾病后遗症特点加减化裁而形成参芪扶正汤。方中丹参为君药，入血分，具有活血化瘀止痛之功及祛瘀生新之效，《妇人名理论》有“一味丹参散,功同四物汤”之说，表明丹参可针对盆腔炎性疾病后遗症“瘀”“虚”的根本病机。黄芪、党参、白术益气健脾，扶助正气，当归补血、活血，四药共为臣药。赤芍清热凉血、祛瘀止痛，鸡血藤、桑枝祛瘀通络，延胡索活血行气止痛，为佐药。全方共奏益气养血、化瘀止痛之功。众多研究显示，丹参的主要活性成分丹参酮ⅡA除具有抗菌消炎作用外，还能够抑制TGF-β1诱导的相关信号通路，缓解纤维化[10-12]。另外黄芪、丹参配伍后丹参酮ⅡA和丹酚酸B的提取率更高[13]，二者配伍可以增强祛瘀止痛之功[14]。白术能通过抑制TNF-α等炎症因子的产生而发挥抗炎、调节免疫的作用[15]。

盆腔炎性疾病后遗症的主要病理生理学改变是组织粘连、增生及瘢痕形成。研究发现，瘢痕瘤患者血清中TNF-α、TGF-β1水平升高[16]。TNF-α由激活的巨噬细胞产生，是常见的促炎因子，且能促进成纤维细胞增殖,从而利于胶原纤维的形成[17]。TGF-β1是介导胶原合成的最重要的促纤维化标志物，参与组织创伤修复[18]。TGF-β1可通过信号蛋白Smad2/3的活化，促进胶原和纤维连接蛋白等细胞外机制成分的表达，并通过抑制蛋白酶活性和增加蛋白酶抑制剂来抑制细胞外基质的降解，从而诱导多种组织器官中成纤维细胞的增殖、分化[19]。当成纤维细胞增殖, 持续过度分泌胶原蛋白则会产生大量的collagen I，并异常沉积，最终形成粘连、瘢痕。所以TGF-β1是collagen I合成的主要调控因子[20]。综上，抑制TNF-α、TGF-β1表达，有可能抑制collagen I形成，进而抑制瘢痕形成。

本实验结果显示，模型组小鼠MGS评分及上生殖道组织中TNF-α、TGF-β1、collagen I相对表达量明显升高，证实盆腔炎性疾病后遗症小鼠上生殖道存在炎症因子浸润、粘连及瘢痕形成的病理状态。各药物组小鼠MGS评分均明显低于模型组，表明阿司匹林及参芪扶正汤灌胃、灌肠、灌胃联合灌肠均能缓解盆腔炎性疾病后遗症小鼠盆腔疼痛。各药物组小鼠上生殖道组织中TNF-α相对表达量均明显低于模型组，提示阿司匹林及参芪扶正汤灌胃、灌肠、灌胃联合灌肠均可降低炎症因子TNF-α表达。参芪扶正汤各组小鼠上生殖道组织中TGF-β1、collagen I相对表达量均明显低于模型组，提示参芪扶正汤灌胃、灌肠及灌胃联合灌肠均能下调小鼠上生殖道组织中TGF-β1、collagen I表达。但参芪扶正汤各组间小鼠MGS评分及TNF-α、TGF-β1、collagen I表达均未显示出明显差异，提示参芪扶正汤灌胃联合灌肠较单一灌胃或灌肠而言，在降低盆腔痛、炎症因子及粘连相关因子表达方面并无明显优势。

综上所述，参芪扶正汤可缓解盆腔炎性疾病后遗症所致的慢性盆腔痛，抑制上生殖道炎症因子及粘连、纤维化相关因子的表达，这可能是其治疗盆腔炎性疾病后遗症的机制之一；参芪扶正汤单一给药方式即可对盆腔炎性疾病后遗症起到一定的治疗效果，无需口服联合灌肠的多途径给药。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。