基于AMPK/PGC-1α信号通路探讨乌萸汤对初老小鼠卵母细胞的作用机制

付寒雪，赵嘉静，黄文玲

(1.北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

近年来由卵巢衰老而致的不孕症已成为生殖医学界关注的热点问题[1]。研究表明，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine phosphate activated protein kinases,AMPK)可以直接或间接激活其下游的过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGC-1α)，促进线粒体的生物合成[2]，从而参与卵泡发育、卵泡闭锁、调控卵巢激素合成与分泌等多种途径影响卵巢功能[3]。前期研究发现，以补肾调肝法立法组方的乌萸汤可提高卵巢不敏感综合征模型小鼠血清雌激素水平，降低促卵泡生成素、促黄体生成素水平；上调卵巢抑制素B及卵泡抑素水平，下调激活素水平，有效改善卵巢功能[4]。本研究在前期实验基础上，利用未成熟卵体外培养技术，以线粒体能量代谢为切入点，进一步观察AMPK/PGC-1α通路对初老小鼠卵细胞质量的影响，并探讨乌萸汤改善卵细胞线粒体功能及卵细胞质量的作用机制，为防治卵巢衰老提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雌性6周龄、24周龄SPF级C57BL/6J小鼠各10只、70只，动物许可证号：斯贝福(北京)生物技术有限公司；SPF级雄性6周龄SD大鼠10只，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物均饲养于北京中医药大学东方医院实验中心动物屏障系统内，SPF环境，12 h明/12 h暗，动物自由饮水。实验符合北京中医药大学东方医院伦理审查要求。

1.2药物及试剂 乌萸汤(山茱萸10 g、乌药10 g、菟丝子15 g、丹参10 g、鸡血藤15 g、肉苁蓉10 g、香附10 g，北京中医药大学东方医院颗粒药房提供，康仁堂药业生产)，山茱萸环烯醚萜苷类提取物(上海陶素生物科技，CAS 131189-57-6)，孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波三生生物科技有限公司，货号：S200808)，人绒毛膜促性腺激素(HCG，宁波三生生物科技有限公司，货号：B200805)，AMPK激动剂AICAR(MCE，2627-69-2)，AMPK抑制剂Compound C(MCE，866405-64-3)，M2培养基(SIGMA，M7167)，羊抗鼠-HRP(博奥森，bs-0295G-HRP)，Super Script Ⅲ RT逆转录kit(ABI-invitrogen，11752050)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKα (Thr172)(CST，2535)，PGC-1α(Genetex，GTX31921)，Nrf1(CST，46743)，Nrf2(CST，12721)，β-actin(proteintech，20536-I-AP)，羊抗兔-HRP(博奥森，bs-0295G-HRP)，石蜡油(Sigma，M8410)。

1.3主要仪器 超净工作台(苏州净化SW-CJ-1FD，中国)，CO2培养箱(SANYO XD-101，日本)，生物倒置显微镜(OLYMPUS，IX51，德国)，体式显微镜(世纪科信，中国)，台式低速离心机(上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2，中国)，荧光显微镜(OLYMPUS-IX51，德国)，荧光定量PCR仪(Eppendorf，X226488N)，分光光度计(THERMO，Nanodrop lite)，0.45 μm PVDF膜(Millipore，IPVH00010)，脱色摇床(海门其林贝尔，TS-100)，电泳仪(Biorad，EPS 300)。

1.4实验方法

1.4.1乌萸汤含药血清制备及保存 参考李玲等[5]实验最优效剂量，乌萸汤按原药材浓度4.8 g/mL配制，计算每日灌胃药液1 mL/100 g。SD大鼠适应性喂养3 d后，连续灌胃乌萸汤7 d，第7天灌胃后1 h无菌条件下腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min分离血清，滤器抽滤除菌，56 ℃灭活，分装，-20 ℃保存备用。

1.4.2原代细胞提取 ①培养液解冻24 h以上，配置M2培养基为基础培养基，含药培养基用基础培养基将药物稀释至乌萸汤含药血清10%、山茱萸环烯醚萜苷类提取物20 mg/L。②在35 mm培养皿中做好清洗液滴和培养液滴，每滴20 μL，覆盖2 mL石蜡油后置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱平衡过夜，手术器械高压灭菌。③6周龄和24周龄雌性清洁级C57BL/6J小鼠分别腹腔注射PMSG 10 IU ，48 h后注射 HCG 10 IU，16 h后颈椎脱臼处死小鼠，置于无菌超净工作台中，解剖取出卵巢，于清洗液滴中清洗并剥离脂肪组织，在体式显微镜下用1 mL注射器针头扎破卵巢，待内含物溢出后挑取卵丘卵母细胞复合体(COC)。将所取得COC置于培养液滴中培养，控制每个培养液滴的COC数量为8～10个，收集细胞用于后续实验。

1.4.3实验分组及培养 实验分设8组：对照组将6周龄小鼠COC培养于基础培养基，初老组将24周龄小鼠COC培养于基础培养基，初老+AICAR组加入AICAR预处理24周龄小鼠COC 2 h后培养于基础培养基，初老+Compound C组加入Compound C预处理24周龄小鼠COC 2 h后培养于基础培养基，初老+乌萸汤含药血清组将24周龄小鼠COC培养于乌萸汤含药血清培养基，初老+乌萸汤含药血清+AICAR组加入AICAR预处理24周龄小鼠COC 2 h后培养于乌萸汤含药血清培养基，初老+乌萸汤含药血清+Compound C组加入Compound C预处理24周龄小鼠COC 2 h后培养于乌萸汤含药血清培养基，初老+山茱萸环烯醚萜苷类提取物组将24周龄小鼠COC培养于山茱萸环烯醚萜苷类提取物培养基。各组均培养24 h。

1.5检测指标及方法

1.5.1细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表达情况 采用Real-Time PCR方法检测：各组分别取等量卵母细胞，应用Trizol法提取总RNA，1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测RNA的完整性。反转录试剂盒superscript Ⅲ反转录合成cDNA，对cDNA样本进行扩增，配置实时定量PCR反应体系，于荧光定量PCR仪上检测细胞中AMPK、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表达情况。引物序列 ：ACTB上游5’-CCATGTACGTAGCCATCCAG-3’,下游5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG-3’；AMPKa上游5’-GTTGGACGAAAAGGAAAGC-3’,下游5’-TTCTGGTGCGGCATAATTGG-3’；PGC-1α上游5’- TTCCACAGATTCAGGCCAGT-3’,下游5’-CTGAAGTCGCCATCCCTTAG-3’；NRF1上游5’-CATCCAGACGACGCAAGCAT-3’,下游5’-ATCTGTCCCCCACCTTGTAA-3’；NRF2上游5’-GGCATTTCACTGAACACGAG-3’,下游5’-GATGACCAGGACTCACGGGA-3’。PCR反应体系50 μL，反应条件：95 ℃变性3 min进入循环，95℃ 30s、55 ℃ 20 s共40个循环。采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.5.2细胞中AMPKα及p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、NRF1、NRF2蛋白表达情况 采用Western blot法检测：应用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法蛋白浓度定量，根据浓度测定结果用5×loading buffer对蛋白浓度进行调整，保证各组别蛋白浓度一致。配置适宜浓度的浓缩胶和分离胶，测得每孔上样量为50 μg，80 V 浓缩胶，120 V 分离胶，恒压电泳分离蛋白，电泳至目的蛋白位于分离胶面的下1/3的最佳分辨位置时停止电泳。4 ℃下110 V/120 mA转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h，加一抗AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、NRF1、NRF2及β-actin，4 ℃孵育过夜，洗去多余的一抗，而后加入相应二抗，37 ℃摇床孵育1 h，TBSB洗膜3次，每次10 min后显色曝光，应用Image J软件分析灰度值，以β-actin为内参，计算出各个指标的相对灰度值。

2 结 果

2.1各组卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表达情况 初老组、初老+AICAR组、初老+Compound C组、初老+乌萸汤含药血清+Compound C组、初老+山茱萸环烯醚萜苷类提取物组卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相对表达量及初老+乌萸汤含药血清+AICAR组Nrf2基因相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05)；初老+AICAR组、初老+乌萸汤含药血清组、初老+乌萸汤含药血清+AICAR组卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1基因相对表达量均明显高于初老组(P均<0.05)，初老+AICAR组、初老+乌萸汤含药血清组、初老+乌萸汤含药血清+AICAR组卵母细胞中Nrf2基因相对表达量及初老+Compound C组卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相对表达量均明显低于初老组(P均<0.05)；初老+乌萸汤含药血清+Compound C组卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相对表达量均明显低于初老+乌萸汤含药血清组(P均<0.05)；初老+乌萸汤含药血清组、初老+乌萸汤含药血清+AICAR组各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠卵母细胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表达情况

2.2各组卵母细胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1、Nrf2蛋白表达情况 初老组、初老+Compound C组卵母细胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相对表达量及初老+AICAR组p-AMPKα(Thr172)、Nrf1蛋白相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05)；初老+AICAR组、初老+乌萸汤含药血清组卵母细胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相对表达量及初老+乌萸汤含药血清+AICAR组卵母细胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α蛋白相对表达量均明显高于初老组(P均<0.05)，初老+乌萸汤含药血清+Compound C组卵母细胞中p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相对表达量均明显低于初老+乌萸汤含药血清组(P均<0.05)。见图1及表2。

表2 各组小鼠卵母细胞中AMPKα、p-AMPKα (Thr172)、PGC-1α、Nrf1、Nrf2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

线粒体能量代谢是关乎卵细胞质量的重要因素。线粒体是卵细胞中数量最多的细胞器，其通过氧化磷酸化和电子呼吸链产生三磷酸腺苷(ATP)，是细胞的能量工厂[6-7]。线粒体保持正常的数量和活性对于卵泡发育至关重要，线粒体功能障碍可诱导卵巢衰老[8]。AMPK是一种丝、苏氨酸蛋白激酶，是调节细胞能量代谢的关键分子，被称为细胞能量调节器[9]。相关研究发现，α1AMPK基因敲除的小鼠，其卵细胞线粒体结构异常，ATP含量减少，受精卵发育潜能下降[10]，提示AMPK能够调节卵细胞线粒体的能量代谢，继而影响卵细胞质量。PGC-1α是一个重要的转录共活化物，可通过调节线粒体合成参与生物体的能量代谢过程, 还可调控核呼吸因子(NRFs)的转录[11-12]。而NRFs是调节线粒体氧化磷酸化和线粒体合成的重要转录因子，通过直接转录调控或间接调控参与与线粒体氧化磷酸化有关的呼吸酶链亚单位基因表达。因此，PGC-1α能通过调控 NRFs 的基因转录，调节线粒体氧化磷酸化功能，从而参与生物体的能量代谢[13-14]。中医理论中将卵巢的功能统归于胞宫，以“经血”来判断卵巢功能正常与否[15]。月经的产生与肝、肾关系最为密切。“肾藏精，主生殖”，精血同源，肾精是产生月经的物质基础。肾精不足，精亏血少，冲任血虚，胞宫胞脉失养，经水渐断。肾精衰少是卵巢功能减退的根本原因。现代女性生活、工作压力大，求子不得，情绪不能有效宣泄，久而致郁。肝郁气滞，疏泄无权，气滞日久，而成血瘀，阻塞胞宫胞络，故经水难下，胎孕难成。据此，认为肾虚肝郁是卵巢功能衰退的基本病机，临床中以补肾调肝为基本治法[16]。乌萸汤是北京中医药大学东方医院金哲教授改善卵巢功能的经验效方，可补肾以助先天，调肝以畅气血，而达调经种子目的。动物实验证实乌萸汤可通过调控卵巢局部因子、增强FSHR mRNA的表达从而提高卵巢对促性腺激素的反应性,改善下丘脑-垂体-卵巢轴,刺激雌二醇分泌,以促进卵泡发育成熟及排出[17]。

1为对照组；2为初老组；3为初老+AICAR组；4为初老+Compound C组；5为初老+乌萸汤含药血清组；6为初老+乌萸汤含药血清+AICAR组；7为初老+乌萸汤含药血清+Compound C组；8为初老+山茱萸环烯醚萜苷类提取物组

本研究中通过对照组、初老组、初老+AICAR组、初老+Compound C组的对比发现，激活剂AICAR促进了AMPKα转录及p-AMPKα(Thr172)的表达，加强了AMPK的活化，导致其下游分子PGC-1α表达增加，并主要影响核呼吸因子Nrf1的蛋白表达，使得通路被激活，进而改善卵细胞线粒体功能；抑制剂Compound C加入后抑制了AMPKα的表达及活化，下调了其下游分子PGC-1α、Nrf1的蛋白表达。提示卵巢衰老过程中出现的卵细胞质量下降与AMPK/PGC-1α通路对线粒体能量代谢的调控有关。加入乌萸汤含药血清培养的研究证实，乌萸汤可以促进AMPKα、PGC-1α、Nrf1的转录及AMPKα、PGC-1α、Nrf1蛋白表达，可增强初老小鼠卵巢线粒体代谢，改善小鼠卵巢功能；Compound C可以抑制AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2的转录，下调p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白表达，说明抑制AMPK/PCG-1α通路能减弱乌萸汤对初老小鼠线粒体代谢和卵巢功能的改善作用；AICAR的转录激活作用不明显，由此猜测，乌萸汤和AICAR作用可能相近，也可能乌萸汤抑制了AICAR的激活作用。

综上所述，乌萸汤可能通过AMPK/PCG-1α通路增强线粒体能量代谢及氧化应激状态，从而促进卵细胞成熟，改善卵细胞质量，为临床应用补肾调肝法治疗卵巢衰老相关疾病提供了理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。