逆境胁迫对药用植物药效成分积累的影响

苏 琦，张 珂，黄淑琪，朱希强，刘晓鹏,3，姜 宁,3*

(1.湖北民族大学 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；3.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

植物在受到环境胁迫时，往往通过自身产生的次生代谢产物来抵御外界环境胁迫，以保证植物的生长发育，这些次生代谢产物通常也是药用植物的主要药用成分[1].其中逆境胁迫，即非生物胁迫，是环境胁迫的主要胁迫方式之一，包括干旱胁迫、高温胁迫、低温胁迫、盐胁迫、金属及其衍生物胁迫、紫外胁迫等.由于药用植物由野生走向栽培历史较短，尚未形成适于栽培的优良品种[2]，因此采用逆境胁迫模拟野生环境以提高品质成为药用植物栽培的新模式.近些年来，为了探索药用植物适应恶劣环境的生理机制和寻找提高药用植物药效成分积累的方法，不少学者对在逆境胁迫的影响下药用植物生理生化的变化展开了研究.已有研究指出逆境胁迫对植物药效成分，如酚类、萜类、生物碱类等次生代谢产物含量的影响显著.，本文对近些年来关于逆境胁迫对药用植物药效成分积累影响的研究现状进行了综述并提出展望，为后续研究药用植物体内药效成分受逆境胁迫影响的理论研究提供依据，为实现药用植物的定向栽培、提高药用植物的品质提供思路和模式.

1 逆境胁迫对药用植物酚类化合物的积累

酚类化合物是已知植物中最大的次生代谢物组，分为简单酚类和多酚，多酚又分为酚酸、黄酮类、二苯乙烯类和木脂素类等，这些化合物起源于苯丙氨酸，因此也被称为苯丙烷类[3].酚类化合物是多种药用植物的活性成分，具有降血糖[4]、保护心血管[5]、抗氧化、抗炎和抗癌[6]等作用.现代研究表明对药用植物进行适当的逆境胁迫能提高酚类化合物的含量.

观赏植物蔷薇科(Rosaceae)绣线菊属(SpiraeaL.)和海桐科(Pittosporaceae)海桐花属(Pittosporum)的药理作用已被现代研究证明[7-8]，Elansary[9]采取两种灌溉水平(蒸散率100%和50%)，同时将岩衣藻(Ascophyllumnodosum)提取物分别以5、7 mL/L进行根部灌溉或叶面施肥处理小花绣线菊(Spiraeanipponica)和橙香海桐(Pittosporumeugenioides)8周，发现两种植物的酚和黄酮含量在干旱胁迫下(蒸散率50%)均显著升高，施加海藻提取物后，酚和黄酮含量会进一步升高，说明干旱胁迫有利于小花绣线菊和橙香海桐酚类化合物的积累.Caser等[10]采用3种灌溉方式(100%、50%和0%容器水容量)研究了干旱胁迫对铜叶天蓝鼠尾草(SalviasinaloensisFern.)总酚类的影响，结果表明当100%容器水容量灌溉时，植物总酚含量逐步下降，在21～25 d之间达到最低值0.98 mg/g鲜重；相反，经中度干旱胁迫(50%容器水容量)后，鼠尾草的总酚量在此期间达到最高值(21 d和25 d的量分别达到14.26 mg/g鲜重和13.16 mg/g鲜重)，而重度胁迫(0%容器水容量)的植物则在第11天最高(15.74 mg/g鲜重).同样，对照处理的0～7 d内的总黄酮含量逐渐上升，而后逐步下降，第25天时降至最低点(1.16 mg/g鲜重)；中度胁迫，总黄酮含量开始21 d内保持不变，随后上升至最高点(25 d时2.89 mg/g鲜重)，重度胁迫的最高值则在第11天，达3.73 mg/g鲜重.

Rezaie等[11]对罗勒(OcimumbasilicumL)在低温胁迫条件下酚类化合物及其生物合成途径中关键酶-苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性的变化进行了研究.作者将罗勒苗在4 ℃和10 ℃下培养，分别于12、24、48 h取样，检测叶片中的总酚含量和PAL活性.结果发现：与对照相比，低温胁迫能显著提高总酚含量，4 ℃培养时，胁迫12 h总酚含量最高为14.57 mg GAE( gallic acid equivalents，没食子酸当量)，10 ℃条件下，胁迫24 h，总酚量最高，达14.91 mg GAE，同时，PAL活性与总酚含量呈显著正相关.

Abbas等[12]采用紫外胁迫与盐胁迫苦瓜(MomordicacharantiaL.)种子，检测出苗21 d的幼苗中总酚和总黄酮的含量，结果发现，种子经紫外照射5 min和10 min后，总酚和总黄酮含量均显著升高，其中照射5 min的总酚和黄酮均最高；而经250 mmol/L NaCl处理后，幼苗的总酚与总黄酮的量最高.

Salinitro等[13]分别用不同浓度的CdCl2、CrCl3、CuSO4、NiCl2、Pb-EDTA和ZnSO4处理扁蓄(PolygonumaviculareL.)与欧洲千里光(SeneciovulgarisL.)4周后，检测新枝的总酚含量，结果表明两种植物的多酚和黄酮含量均显著升高.

植物酚类化合物是通过苯丙烷途径合成的.最初是4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)结合生成苯丙氨酸.然后，在PAL催化下苯丙氨酸转化成反式-肉桂酸，该途径被命名为苯丙烷途径.其他酚类物质如黄酮类、香豆素、水解单宁等也是通过这一途径合成的.酚类化合物的产生是由于植物在进化过程中与逆境的相互作用[14].逆境胁迫导致植物生理和生化过程，会快速产生过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并呈指数级增长[15].应激环境下，植物会通过酚类化合物清除ROS.酚类的产生是通过提高酚类生物合成途径中关键性酶的活性，如PAL、肉桂酸4-羟化酶((cinnamate 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)、查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、黄烷酮3羟化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)、类黄酮3’-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)、类黄酮3’5’-羟化酶(flavonoid 3’5′-hydroxylase,F3′5’H)、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、黄酮醇合酶(flavonol synthase，FLS)、异黄酮还原酶(isoflavone reductase，IFS)、UDP类黄酮糖基转移酶(UDP flavonoid Glycosyltransferase，UFGT)等.酶活性的提高也伴随着上调编码这些酶的基因转录水平[16-18].因此，逆境胁迫使植物酚类化合物含量升高的机制是：逆境胁迫激活了酚类的生物合成途径，上调相关基因表达和增强相关酶活性，从而提高了酚类物质的含量，加速了ROS的清除，提高了植物的ROS耐受.

2 逆境胁迫对药用植物萜类化合物的积累

萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，在植物体内有甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)途径或2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径合成，具抗肿瘤[19]、镇痛[20]、抗氧化[21]、抗抑郁[22]、抗炎和抗流感病毒[23]等作用.通过逆境胁迫提高药用植物萜类化合物含量已成为研究热点.

Mahdavi等[24]研究了百里香(Thymusvulgaris)干旱胁迫下挥发油成分的变化，结果表明：无论敏感品种还是耐旱品种，干旱胁迫的植株内β-月桂烯(β-myrcene)、β-蒎烯(β-pinene)、罗勒烯(ocimene)，γ-松油烯(γ-terpinene)、α-水芹烯(α-phellandrene)、百里香(thymolo)、β-石竹烯(β-caryophyllene)的含量均高于对照组，只是敏感品种最高值出现在胁迫后第4天，而耐旱品种出现在8～12 d.

Ghasemi等[25]采用紫外胁迫对孜然(CuminumcyminumL.)胁迫1和2 h，然后分别在胁迫后3、6、9、12 h采样，检测番茄红素、β-胡萝卜素与总萜含量的变化，结果发现，紫外照射后，与对照组相比，紫外照射1 h处理后，番茄红素在9 h时达到最高点，紫外处理2 h的组别，6 h的番茄红素含量最高，与1 h处理3 h后的样品相当；β-胡萝卜素的含量，紫外处理1 h后，一直维持在较高水平，各时间段均高于对照组和紫外胁迫2 h的试验组；紫外胁迫2 h后6 h的样品总萜含量最高.因此，紫外胁迫能有效提高番茄红素、β-胡萝卜素、总萜的量.

Liu等[26]研究了低温胁迫青蒿(ArtemisiaannuaL.)对青蒿素积累的影响，并揭示与内源茉莉酸(jasmonate)的关系.他们将青蒿于4 ℃培养48 h进行低温胁迫，发现胁迫组的青蒿素、青蒿素B、二氢青蒿酸和青蒿酸的量均显著高于对照组，青蒿素、青蒿素B在处理48 h时含量最高，二氢青蒿酸和青蒿酸的含量为24 h时最高；低温胁迫能提高内源茉莉酸的浓度，且上调内源茉莉酸生物合成的相关基因和茉莉酸应答转录因子的表达；低温胁迫还能提高青蒿素合成关键酶的基因表达.因此，作者认为低温胁迫后，茉莉酸的合成基因上调使其合成增加，从而使茉莉酸应答转录因子上调，然后青蒿素生物合成基因的表达水平也提高，最终青蒿素含量增高.

Heydari等[27]分析了伊朗地区50年的气象资料，选择了26～40 ℃和27～45 ℃两种高温，并将常温(14～32 ℃)作为对照，研究了高温胁迫对两种薄荷变种(Mentha×piperitaL.var.Mitcham和Menthaarvensisvar.piperascensMalinv.ex L.H.)精油成分及其抗菌活性的影响.研究发现，两个变种薄荷中含量经热胁迫后显著上升的成分有：单萜烯的p-2-薄荷烯(p-2-menthene)和柠檬烯(Limonene)，含氧单萜的薄荷呋喃(Menthofuran)、甜薄荷萜(Pulegone)、醋酸薄荷酯(Menthyl acetate)、氧化哌啶酮(Piperitenone oxide).抑菌实验结果显示经高温胁迫后精油的抑菌活性也显著提高.说明高温胁迫能提高薄荷精油抑菌有效成分的量.

Yadav等[28]在青蒿(ArtemisiaannuaL.)整个生长期采用50、100、200 mmol/L的NaCl胁迫，检测营养早期、中期、晚期以及盛花期叶片中青蒿素、青蒿素B、青蒿酸+双氢青蒿素酸的含量.结果表明，营养早期，各活性物质含量均较低，进入营养中期后，盐胁迫后的活性化合物的含量均高于对照.

除了单一胁迫，复合胁迫方式也常被用作提高药用植物活性成分的重要方法.Pellegrini等[29]研究了干旱和O3复合胁迫对狭叶连翘(Phillyreaangustifolia)萜类化合物的影响，发现当O3每小时平均浓度为35×10-9时，以40%田间水容量(field capacity，FC)灌溉(胁迫)的植物内萜类化合物显著减少，但在65×10-9的O3胁迫下，无论100%还是40% FC灌溉的连翘，萜类含量均显著上升，且干旱胁迫的上升幅度更大.Bami等[30]研究了苦艾(ArtemisiaabsinthiumL.)在NaCl和TiO2复合胁迫下能提高青蒿素的浓度，并上调青蒿素生物合成途径中两个关键酶氨苯二酸合酶(Amorphadiene Synthase，ADS)、双键还原酶2(Double-Bond Reductase 2，DBR2)的基因表达.

一般认为，植物在逆境条件下，如干旱胁迫下会关闭气孔以减少蒸腾作用，紫外胁迫破坏光合系统，从而使通过Calvin循环固定CO2的量减少，造成还原力(如NADPH+H+)过量积累，植物会促进各种反应包括萜的生物合成去消耗过量的还原力[25,31].

萜类化合物分别来自MVA途径的异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和MEP途径的二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，二者以不同的比例缩合可诱导产生无环前体，即法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)、香叶基二磷酸(geranyl diphosphate，GPP)和香叶醛二磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP).萜烯合成酶(Terpene synthases，TPSs)催化这些前体合成多种结构多样的环状和无环萜类、单萜类、倍半萜类、二萜类以及其他萜类[32].因此，TPSs是合成萜类化合物的关键酶.胁迫能提高TPSs，如羟甲基戊二酰辅酶A(Hydroxymethylglutaryl-CoA，HMG-CoA)还原酶、GPP合酶、脱氧木糖磷酸合成酶(Deoxy-xylose phosphate synthase，DXS)和脱氧木糖磷酸还原酶(Deoxy-xylose phosphate reductase，DXR)等的活性，并能上调相关基因的表达[25,33].

3 逆境胁迫对药用植物生物碱的积累

生物碱是一类含氮杂环化合物，在植物体内主要参与胁迫损伤的防御.不同的生物碱，生物合成途径各异.生物碱具有多种药理活性，如抗炎[34]、降血糖[35]、抗肿瘤[36]、抗氧化[37]、保护心血管[38]等作用，是重要的药用植物活性成分.对药用植物进行适当胁迫，可提高生物碱的含量.

Misra等[39]采用水杨酸(Salicylic acid，SA)与NaCl胁迫药用植物长春花(Catharanthusroseus)，探究了不同处理对长春花生物碱含量的影响.结果表明与对照组相比，盐胁迫都会显著增加生物碱总量，其中100 mmol/L NaCl处理的增加最显著.刘佳等[40]的研究发现采用25、50 μmol/L NaCl溶液喷洒半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit]幼苗时，生物碱含量显著下降，100 μmol/L NaCl溶液处理的生物碱含量与空白组的无显著差异，当NaCl浓度提高至150、200 μmol/L时，生物碱显著升高.说明，通过喷洒叶面的方式，适度的盐胁迫也能提高生物碱的含量.

张智仙等[41]通过连续土壤控水方式，研究了一年生钩藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil]在持续土壤自然干旱胁迫下药用成分含量的变化.结果表明，土壤自然干旱胁迫4～8 d有利于主要药效成分钩藤碱与异钩藤碱的积累；土壤相对含水量在42%～53%时，钩藤幼苗耐旱性较强且钩藤碱与异钩藤碱含量较高.王彤彤等[42]研究了干旱胁迫对半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit]生物碱含量的影响，发现轻度和中度干旱处理35 d，半夏生物碱含量分别增加了2.23倍和2.28倍；说明轻、中度干旱处理有助于生物碱的积累.

刘英等[43]对遮光胁迫下外源一氧化氮(NO)对长春花幼苗生物碱积累的影响进行了研究.他们采用外施NO供体、遮光55%～60%处理、外施NO供体+遮光处理，7 d后对不同处理的叶片测定长春质碱、文多灵碱、长春碱、长春新碱的含量.研究表明，单纯外施NO，4种生物碱的含量没有显著变化；遮光处理，生物碱的含量稍有增加，但不显著；复合处理能显著提高4种生物碱的含量.

卢克欢等[44]的研究结果表明，短时间紫外胁迫可促进颠茄(AtropabelladonnaL.)莨菪碱的积累，长时间的紫外胁迫则会抑制莨菪碱的合成；紫外胁迫使东莨菪碱的含量持续下降；在紫外胁迫的同时，叶面喷施CaCl2溶液后，会缓解紫外对生物碱合成的抑制作用.

由于生物碱的生物合成途径各异，逆境胁迫对生物碱积累影响的机制主要是针对具体生物碱合成途径，采用蛋白组学、代谢组学、转录组学分析进行研究.Zhu等[45]的研究表明，对长春花幼苗分别进行紫外胁迫处理后，再暗培养72 h，叶中的山茱萸碱、长春花碱和狭毒碱的含量显著升高；定量蛋白质组学分析结果显示：与氧化戊糖磷酸、三羧酸(TCA)循环、细胞壁、糖酵解、转运、氨基酸代谢、次生代谢、主要CHO代谢等相关的蛋白质丰度显著增强，另外，与吲哚生物碱生物合成途径的10-羟基香叶酮氧还原酶(10-hydroxygeraniol oxidoreductase，10-HGO)高于对照2倍；qRT-PCR分析结果也显示，与生物碱合成相关的6-17-O-脱乙酰基乙烯二酰乙酰转移酶(6-17-O-deacetylvindoline O-acetyltransferase，dat)、薄荷碱16羟化酶(tabersonine 16-hydroxylase，t16h)、脱乙酰氧基长春花碱4-羟化酶(deacetoxyvindoline 4-hydroxylase，d4h)、十八烷衍生物响应性长春花AP2结构域蛋白3(Octadecaniod-derivative Responsive Catharanthus AP2-domain Protein，ORCA3)、香叶醇-10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase，g10h)和10hgo基因mRNA表达上调；同时检测到长春花体内的ROS指标上升.因此，作者认为在紫外和黑暗胁迫下，植物产生氧化应激，为了提高清除ROS能力，植物激活了与生物碱生物合成相关途径的关键酶活性，上调基因和转录因子的表达，使生物碱积累；同时，他们还认为TCA循环相关蛋白丰度的升高也有利于次生代谢产物的合成，因为TCA循环能提供合成的能量和中间体.Jia等[46]对碱盐胁迫的海棠(Malushalliana)进行生理学、蛋白组学和代谢组学分析，结果发现：碱盐胁迫后，与氨基糖与核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、光合作用、抗坏血酸和醛酸代谢、苯丙烷代谢、色氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢相关的蛋白含量增加；代谢最活跃的10大途径为：吲哚生物碱生物合成，苯丙烷合成，托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成，苯丙氨酸代谢，ABC转运蛋白，莽草酸途径衍生生物碱合成，碳水化合物消化与吸收，生物素代谢，矿物吸收，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；参与吲哚生物碱生物合成的色氨酸和长春花碱的大量积累.作者认为：糖代谢，为其他代谢提供底物和能源，在植物的抗胁迫中起到至关紧要的作用；同时，糖作为信号分子促使D-苯丙氨酸和色氨酸的积累，从而使其他氨基酸含量升高，提高植物抗氧化能力，并且这些氨基酸也是生物碱合成的前体.因此，糖信号途径通过提高生物碱和生长素的合成来维持ROS的稳态.

综上，通过蛋白组学、代谢组学、转录组学的分析，可以推测出逆境胁迫提高生物碱含量的分子机制：胁迫下产生ROS，ROS作为信号分子，激活相关信号通路，上调生物碱生物合成需要的关键酶的基因表达和活性，从而提高生物碱含量.

4 展望

关于逆境胁迫对药用植物药效成分积累影响的研究，已取得重大进展，但依然有许多不足：① 大量研究仅限于药用植物抗逆性的机理、生理生化反应和分子机制，而忽略了药用植物本身的应用价值，对逆境胁迫下药用成分积累的分子机制研究较少；② 研究对象大都局限于实生苗，研究周期长，且由于基因差异，研究结果重复性有待商榷；③ 理论成果与指导生产脱节，如何将研究成果推广并取得经济效益，是科研工作者将面临的重大课题.

随着现代药理技术的发展，新的药用植物的药用成分会被大力开发，分子生物学、基因组学、代谢组学和转录组学的蓬勃发展，有针对性地阐明各种药用植物有效成分的结构、代谢途径和调控，以及各途径间的对话(cross talk)，重点是生物合成途径的关键酶基因序列、表达调控等，为药用植物的开发提供科学依据.

将现代组织培养技术、无土栽培技术应用于药用植物的扩繁和生产，实现药用植物的快繁，减少个体的基因差异，缩短研究周期，减小个体差异，是今后利用逆境胁迫积累药用成分的有效手段.

随着农业种植技术的提高，如植物工厂等的应用，使科研成果应用于生产实际成为可能.在植物工厂中对药用植物有目的地进行逆境胁迫，定向生产积累所需药用成分的药材，缩短生产周期，实现药用植物的工业化生产，大幅度提高经济效应，是未来中药生产的方向.