胃腺癌组织中免疫组织化学与AB-PAS组织化学组合染色技术

郑伟，陈淑勤

（福建医科大学1基础医学院病理学系，2病理诊断中心，3肿瘤研究室，福州350004）

胃癌的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的复杂过程。在日常病理诊断及鉴别诊断中，比较常用的免疫组织化学Ki-67（细胞核阳性）、CEA（细胞质阳性）、EMA（细胞膜/质阳性）等，以及酸性、中性黏液染色（AB-PAS），可用于判断该肿瘤的发生、发展、浸润转移及预后，以及鉴别胃癌细胞向胃、肠两方向分化的特征等。以上染色，传统的作法是各自分别呈现在不同的切片上，或有文献报道蛋白表达（单一定位）与特染进行组合染色。为了更加直观免疫组织阳性表达与特殊染色（ABPAS）的关系，本文在胃腺癌同一张切片进行免疫组织化学与AB-PAS组合染色，观察蛋白标志物不同定位（细胞核、细胞质、细胞膜）与酸性、中性黏液成分形态学间相互关系。

材料与方法

1 材料

胃腺癌标本，经10%中性福尔马林固定，70%～100%梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，组织切片厚4 µm。

2 试剂

阿利辛蓝（AB）染液( pH 2.5) 阿利辛蓝8GS （Sigma）1.0 g，蒸馏水 97 mL，冰醋酸 3 mL， 麝香草酚（国药集团化学试剂有限公司）50 mg。1%过碘酸溶液：过碘酸（国药集团化学试剂有限公司）1 g，蒸馏水100 mL。Schiff试剂：双蒸水200 mL加热到沸腾，加入碱性品红（国药集团化学试剂有限公司）1 g，搅拌，继续煮至完全溶解；移开火源冷却至50 ℃，加入1 mol/L盐酸10 mL，混匀；待冷却至35 ℃，加入偏重亚硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）1 g，摇匀，避光冷藏12～24 h，溶液变为草黄色时，加活性碳2 g，摇匀过滤于洁净的磨沙口玻璃瓶内，盖严，4 ℃保存。免疫组织化学试剂：鼠抗人单克隆第一抗体（即用型）包括抗Ki-67 (克隆号：SP6)、抗CEA（克隆号：MX068)和EMA（克隆号：E29)，ElivisionTM plus试剂盒（鼠/兔）（Kit-9902）和DAB Kit（20×）购自福州迈新公司。

3 Ki-67、CEA或EMA免疫组织化学与AB-PAS组合染色

3.1 先免疫组织化学染色后AB-PAS染色

根据第一抗体的要求，对组织切片进行相应的抗原修复，冷却至室温后取出切片，自来水洗，PBS冲洗3 min×2，滴加3%H2O2室温下孵育10min，阻断过氧化物酶， PBS冲洗3 min×3；滴加抗Ki-67、CEA、EMA等即用型一抗，室温下孵育60 min，PBS冲洗3 min×3；滴加反应增强液，室温下孵育20 min，PBS冲洗3 min×3；滴加过氧化物酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，室温下孵育30 min，PBS冲洗3 min×3；滴加新鲜配制的DAB显色，继而蒸馏水浸洗1 min；先后滴加3%醋酸液2 min和阿利辛兰染色液（pH 2.5）染色10～20 min；滴加3%醋酸分化液分化（必要时），流水冲洗；滴加1%过碘酸溶液于切片上10 min，自来水冲洗1 min，蒸馏水洗1 min；浸入Schiff试剂中，室温避光染色5～15 min；自来水冲洗5 min，蒸馏水洗1 min；乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封固。

3.2 先AB-PAS染色后免疫组织化学染色

组织切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗，按前述方法先行AB-PAS染色，蒸馏水洗1 min；对组织进行相应的抗原修复，冷却至室温后取出切片，自来水洗，PBS冲洗3 min×2，之后按照3.1中免疫组织化学染色操作步骤执行，DAB显色，自来水冲洗终止显色，乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封固。

结果

按3.1方法染色后，可见Ki-67、CEA和EMA免疫组织化学反应阳性产物均呈棕褐色（图1A—C），其中Ki-67阳性产物定位于细胞核（图1A），CEA阳性产物定位于细胞质（图1B），EMA阳性产物定位于胞质和细胞膜（图1C）。AB-PAS染色显示胃黏膜中性黏液呈紫红色，酸性黏液呈蓝色（图1）。 以上3组多重染色显示各成分染色表达清晰。按3.2方法染色后，可见免疫组织化学反应阳性产物CEA呈棕褐色，AB-PAS染色中性黏液脱色，酸性黏液呈蓝色数量减少（图1D）

图1 胃腺癌组织Ki-67、CEA和EMA免疫组织化学染色与AB-PAS组合染色不同染色顺序效果比较。A—C，先免疫组织化学染色后ABPAS染色；A，Ki-67免疫组织化学与AB-PAS组织化学组合；B，CEA免疫组织化学与AB-PAS组织化学组合；C，EMA免疫组织化学与AB-PAS组织化学组合。D，先AB-PAS染色后CEA免疫组织化学染色；比例尺，100 µmFig. 1 Comparison of Ki-67, CEA and EMA immunohistochemical staining combined with AB-PAS staining in different staining sequences in gastric adenocarcinoma. A to C, immunohistochemical staining followed by AB-PAS staining; A, Ki-67 immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry; B, CEA immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry; C. EMA immunohistochemistry combined with AB-PAS histochemistry. D. AB-PAS staining followed by CEA immunohistochemical staining; scale bar, 100 µm

讨论

Ki-67与肿瘤的发生、发展、浸润转移及预后有密切联系，目前常用来反映肿瘤细胞增殖活性，评价肿瘤预后。Ki-67阳性表达率越高，肿瘤细胞恶性程度越高。有研究显示，Ki-67与胃腺癌的浸润转移有关，阳性表达的患者预后较差[1]。癌胚抗原（CEA）是一种酸性蛋白，在胃肠道腺癌中高表达，主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌，仅识别不典型增生及癌变组织的CEA。EMA是一组糖蛋白，广泛分布在各种正常上皮细胞膜上及其肿瘤中，范围与细胞角蛋白（CK）相似，但对内脏腺上皮的表达优于CK。

AB染液( pH 2.5) 用于显示含唾液酸的上皮性黏液物质，如肠道的杯状细胞、唾液腺的黏液细胞，常应用于肠型胃癌和胃型胃癌的鉴别诊断。中性黏液物质含有氨基己糖和游离的己糖基，酸性黏液物质也含有氨基己糖，并含有各种酸根。前者见于胃黏膜的表面上皮、十二指肠腺等；后者见于呼吸道和消化道的杯状细胞等。胃黏膜表面上皮分泌中性黏液，而胃的肠腺化生或肠型胃癌的癌细胞分泌酸性黏液，但胃型胃癌的癌细胞则分泌中性黏液[2]。这两种黏液在HE染色有时较难区别，但用爱尔新蓝（pH2.5）-高碘酸-无色品红法（AB-PAS）法则很容易区分中性黏液物质和酸性黏液物质。

免疫组织化学与特染的双重染色技术已有报道[3、4]，本文分别探讨了免疫组织化学反应阳性产物定位于细胞核、细胞质和细胞膜的表达与AB-PAS在胃腺癌标本中的组合染色技术。结果表明，先行免疫组织化学染色再行AB-PAS染色，不影响组织内中性、酸性黏液成分的显示；经AB-PAS复染后，也不影响免疫组织化学阳性产物的显示。免疫组织化学与特殊染色组合，要先进行免疫组织化学显色，然后行特殊染色[5]。从实验结果看，DAB呈色的免疫组织化学染色阳性定位不同的指标与AB-PAS组织化学复染，镜下形态均较直观。由此提示免疫组织化学与特染组合方案可行与否，关键是不同阳性表达的色彩要有反差，而与阳性表达的位置关系不大。文献中Ki-67与AB、SR的三重染色[5]，效果良好，也说明色彩反差是考量选择复染的原则。

本实验在操作中，AB染色时，如蓝色过染可用3%醋酸分化背景；PAS染色Schiff试剂后流水冲洗会使紫红色进一步加深，这一步在显微镜下观察如背景稍红，可用95%酒精进行分化。该组合染色，因苏木素与阿利辛蓝（AB）均呈蓝色，故衬染细胞核步骤省略。

综上所述，胃腺癌组织中先行免疫组织化学后与AB-PAS组合染色技术，在同一张切片观察到不同的成分，形态直观，可用于胃癌的鉴别诊断，是值得推广的方法。