piRNAs调控胃癌进程的研究进展

吕梦圆，陈婧，崔宏伟

（1敖汉旗医院检验科，赤峰 024300；2鄂尔多斯应用技术学院，鄂尔多斯017000；3内蒙古医科大学附属人民医院（内蒙古自治区肿瘤医院）科研部，呼和浩特 010020）

胃癌（gastric cancer, GC）是全球与癌症相关的第三大死亡原因。据报道，2018年GC造成约780,000例患者死亡[1]。胃腺癌占所有GC病例的95%，并可能伴有隐匿症状的癌前病变，这直接导致胃癌确诊时常已经处于晚期且通常伴有预后不良[2,3]。因此，开发和改进GC预防和管理策略及工具对于胃癌的控制至关重要。这就需要加强对胃癌的预防，包括高风险人群的识别、早期诊断和早期患者管理、癌前病变的治疗等[4,5]。GC是在胃部正常组织中持续的分子变化与环境/行为危险因素共同影响下发生的，这些因素会破坏胃部正常组织细胞的动态平衡，获得在未经修复的情况下导致肿瘤进展的恶性特征[6,7]。因此，深入探讨与GC相关的分子改变，开发新型的疾病特异性生物标记物和治疗靶标显得尤为重要。

GC相关的分子改变与体细胞突变密切相关，这包括可能破坏基因功能的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）或插入缺失（insertion-deletion, INDEL）[8]。INDEL可导致piRNAs序列发生遗传变异并改变miRNA结合位点，从而增加其对包括胃癌在内的各种癌症的敏感性[9]。此外，例如与许多类型的癌症相关的调节性非编码RNAs及部分表观遗传相关因子的失衡，影响各种GC进程中的多种调节途径[10]。在所有非编码RNAs中，有证据表明piRNAs参与GC进程，具有成为GC预防及治疗的潜在生物标志物的潜力[11,12]。本文将对piRNAs功能及调控胃癌进程等进行概述，为piRNAs在胃癌的预防、诊断和临床应用提供理论依据。

1 piRNAs的生物来源

1.1 piRNAs的概念

piRNAs是一种长度约为 25～33nt，调控mRNA一系列生理功能的调节性非编码RNAs。调节性非编 码RNAs包 括：lncRNA、miRNA、circRNA、siRNA和piRNAs。研究已证实miRNA与siRNA与癌症的进展密切相关，提示调控性非编码RNAs（例如piRNAs）在基因表达中起重要的调节作用，具有作为新的肿瘤标志物的潜力[13]。piRNAs是从干细胞和哺乳动物生殖细胞中分离出来的一类小RNA，与P-element induced wimpy testis (Piwi）蛋白家族联合，形成Piwi复合物来调控基因沉默。piRNAs的表达具有组织特异性，其主要机制是通过调控机体干细胞的生长过程、干预生殖细胞中配子的减数分裂过程等[14]。

1.2 piRNAs的作用途径

piRNAs沉默复合物能够调控基因的转录，修饰双螺旋的转录状态，提示piRNAs可能具有组织特异性表达的特性[15]。piRNAs的作用途径主要分为两条：第一条途径是主要途经，首先在细胞核中合成pre-piRNAs，piRNAs随之生成并且成熟，并将piRNAs和PIWI蛋白连接形成piRNAs沉默复合体，之后再返回到细胞核内进行转录沉默。第二条途径是次要途径，成熟的pre-piRNAs结合AUB形成AUB-pre-piRNAs复合物（图1）。

图1 piRNAs的作用途径Fig. 1 piRNAs biogenesis pathways

AUB-pre-piRNAs是一个可以识别目标mRNA的复合物，介导mRNA降解，在mRNA的切割过程中形成一个次生piRNAs。piRNAs成熟之后与AGO结合，形成更多与原染色体序列相似的piRNAs。由此往复循环，开始次级piRNAs生物发生途径的扩增（图2）。

图2 次级piRNAs生物发生途径Fig. 2 The secondary processing pathway of piRNAs biogenesis

成熟的piRNAs的加工过程包括piRNA前体（pre-piRNA）的产生、5’端和3’端的修饰、核苷酸的甲基化以及成熟piRNAs的产生[16]。piRNAs在动物性腺中的转录主要在异染色质上的piRNA基因簇中被激活。如果蝇的 piRNA 簇包括启动子元件、RNA 聚合酶 II 和下游组件，其启动子区域具有 H3K4me2 二甲基化[17]。RNA聚合酶II和其他转录因子开始进行预启动，可启动piRNAs转录。RNA聚合酶在异染色质DNA模板的3’到5’方向移动，催化piRNAs链的延伸，最终pre-piRNAs生成。Yb体通常位于线粒体周围，pre-piRNAs与生殖质中的细胞质的Yb体结合，可以增强PIWI和piRNAs的装配能力[18-20]。

总体而言，piRNAs可维持基因的完整性、稳定性，参与调控转录与翻译，所以当piRNAs沉默复合体原件失控可能会影响基因的正常转录与翻译，造成基因突变，是肿瘤产生的重要条件[21]。piRNAs生物合成的途径是一个复杂的过程，现在很多现有的研究调查都是从生殖细胞研究中所获得，机制尚未完全阐明，许多piRNAs的通路特征尚不清楚[22]。

2 piRNAs在胃癌中的表达

研究显示，piRNAs作为一类新型非编码小RNA，与microRNAs功能类似，能够在转录后水平介导基因沉默及调节肿瘤进展。一些研究发现piRNA与胃癌的恶性程度密切相关[23]。基因突变可导致 piRNAs途径中的DNA损伤和端粒长度变化，促进肿瘤的发生[24]。Cheng等[25]研究表明，piRNAs水平的正常化能够抑制胃癌细胞的生长，piR_823的模拟物在体内体外均表现出对胃癌细胞生长有抑制作用，在胃癌组织的表达会有所下调；而PiR_651在胃癌患者的外周血中呈现高表达。这些piRNAs因子均具有开发成胃癌标志物的潜力。这可能是因为piRNAs 簇中富含转座子片段，协助 piRNAs对转座子的识别与结合，进而沉默转座子的转录，导致癌症细胞中 piRNAs 簇中piRNA因子的异常表达更活跃。Martinez 等[26]在对胃癌的研究中发现，一半（256/312）piRNAs 处于过表达状态，并进一步指出大多数 piRNAs 均嵌入蛋白编码序列，而非已知的 piRNA 簇。Cui等[27]在为胃癌患者外周血的研究中发现低表达的 piR-823 与肿瘤的浸润深度及淋巴结转移呈正相关。Wang 等[28]报道胃癌中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4 均处于过表达状态，但也有研究认为胃癌组织中PIWI蛋白的表达与癌旁组织的表达差异不具有统计学意义[29,30]。

3 piRNAs在胃癌发病机制中的作用

当胃癌发生时，会发现与癌症相关的基因发生了遗传变异，进而影响肿瘤的进展。在研究胃癌易感性的多项研究中， piRNAs与全基因组的单核苷酸多态性相关[31]。根据全基因组关联研究（GWAS）的基因型数据搜索位于SMADs结合位点的SNP，从癌症基因组图谱（TCGA）数据库下载了胃腺癌的3级人类甲基化450和2级SNP阵列数据，发现有结合位点SNPs与胃癌的生存与风险相关。SNP rs9911630与GC风险之间的关联，在不一样的浸润深度，远处转移，淋巴结转移或TNM分期的亚组中未观察到明显的风险作用[32]。在已发表的全基因组关联研究（GWAS）和GC的全基因组/外显子组测序研究时，发现有三个变体MUC1的rs4072037，PRKAA1的rs13361707和PSCA的rs2294008与GC关联，差异有统计学意义。但是，这些SNP-GC关联的潜在机制仍不清楚[33-35]。Christian通过分析GC相关的piRNAs是否可能介导SNP-GC的关联发现，鉴定表型特异性遗传易感基因座可以增进对GC不同亚型的了解，这对于早期检测，诊断和治疗该恶性肿瘤很重要[36]。插入缺失多态性也存在对piRNAs的潜在影响，发现一些非编码转录和其他染色质介导的调节位点也降低了插入缺失率。这些数据的整体插入缺失率比单核苷酸多态性（SNP）率低约2倍[37]。Zhang等[38]研究揭示，piRNAs片段的改变会对胃的正常功能产生严重的影响。因此，他们认为piRNAs的研究是有助于更好的理解癌症与分子之间联系的一个新兴领域。

4 piRNAs在胃癌中的检测

piRNAs的表达在肿瘤组织中整体上调，表明其发挥致癌基因的作用[38]。目前，高通量测序被用于揭示多种癌症中的新型piRNAs和已知的同工型类型，但有必要进一步研究以更好地了解piRNAs途径所涉及的功能和机制特征。例如，可以进行体外和体内功能测定以研究piRNAs如何调节基因并干扰其功能。piRNAs和其他表观遗传分子（例如，miRNAs或其他参与染色质重塑的蛋白质）之间的潜在相互作用也可以在计算机和蛋白质免疫沉淀测序分析中进行探索。同时，可以进行计算机功能富集和表达定量特征基因座（eQTL）分析，以探索基因-piRNA相互作用以及非编码RNA与靶基因之间的相互作用。此外，也可以通过免疫共沉淀测序的方法，即抗原和抗体通过高通量测序与靶RNA特异性结合分析帮助发现piRNAs的调控靶标[39]。单细胞测序（scRNA-seq）也是探究piRNAs比较前沿的一项测序技术。单细胞转录组测序是应用最广泛的单细胞测序方法，也是目前最热门的测序方法。它可以从单个细胞中提取，逆转录，扩增和测序所有RNA，然后分析测序结果以研究piRNAs的作用。在精准医疗时代，研究piRNAs参与胃癌进程的表观遗传机制，对深入了解癌症的发生，开发新的抗癌方法显得至关重要[40]。

5 小结与展望

胃癌是目前影响世界公共健康的一个重要问题，胃癌的病因很复杂，并且仍然是研究的热点问题，除了环境问题、遗传因素、感染因素之外，在疾病的进程遗传学也中起着重要作用。因此，对piRNAs的遗传学机制的探索，对于帮助临床尽早的提供疾病的治疗的方法至关重要。本文中，我们阐明piRNAs长度在正常组织与肿瘤组织中存在差异。piRNAs序列中存在INDEL多态性可以解释这种现象，这可能会干扰piRNA的功能，从而导致piRNAs介导的调控被破坏。因此，考虑到遗传变异在癌症研究中的相关性以及piRNAs基因中遗传变异的证据，研究piRNAs多态性的影响非常重要。可以通过基因组分析（例如DNA测序）来识别这些变体，并可以进行生物信息学分析以评估功能改变。这些研究可能有助于阐明可能与致癌作用有关的piRNAs的机制特征。此外，如先前报道，与癌症进展相关的piRNAs可以在患者的血液中循环代谢，但并未描述piRNAs如何循环代谢。这一点很重要，因为循环生物标志物因具有较低的侵入性而被优先使用。未来可以通过一种转化方法，开发通过qPCR分析评估piRNAs拷贝数和相对表达的验证研究，且将这些研究结果纳入医学常规检查。还需要强调一点，目前尚无正在进行或已发表的涉及piRNAs的临床试验。因此，鉴于piRNAs分子可用于临床实践（如筛查，诊断和治疗）的新型疾病生物标志物和/或抗癌治疗靶标的前景，进一步研究其参与胃癌相关途径至关重要。