和厚朴酚对心肌梗死小鼠心脏的保护作用

郭艳杰,张 亭，王佳馨，杨长娥，李 涛

(1西安国际医学中心医院心脏内科，西安 710100；2空军军医大学西京医院消化病医院超声诊疗中心；*通讯作者,E-mail:yuanhang-004@163.com)

目前，心血管疾病是人类死亡的主要原因之一[1]。急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)后有药物治疗、微创介入及外科手术等多种治疗策略可供选择，但是MI后心力衰竭的发生率和患病率仍不断增加。尽管近年来药理学研究方面已经取得了长足进步(如β受体阻断剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂等)，但MI患者的死亡率仍很高，5年死亡率为30%～70%[2]。MI后的心脏保护研究仍然迫切。

厚朴是一种用于治疗心脏病和中风等多种心血管疾病的传统中药。和厚朴酚(honokiol, HK)作为厚朴的活性成分，已经被证明可以通过抗氧化和抗炎作用减轻脑缺血再灌注损伤[3]。已经有研究报道和厚朴酚有降低大鼠在MI后发生心律失常的风险[4-6]。但和厚朴酚能否改善MI后心脏功能尚未有研究报道。综合文献中关于和厚朴酚保护心脑血管的作用及其具有抗炎抗氧化等作用的报道，我们推测和厚朴酚可能对MI后心脏具有保护作用。因此，本研究探究和厚朴酚对MI小鼠心脏功能的影响，了解其是否对MI后心脏具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠购买并饲养于空军军医大学实验动物中心(生产许可证号：SYXK-2017-0021)。所有实验均经西安国际医学中心动物福利伦理委员会审核并批准。

1.2 主要试剂与仪器

和厚朴酚(纯度>99.0%)购自上海阿拉丁生化科技公司，异氟烷(纯度>99.9%)购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，TUNEL试剂盒购自美国Roche公司，DAPI购自美国Sigma公司。抗B-cell lymphoma/leukemia-2抗体、抗BCL2 associated X抗体和抗GAPDH抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司。引物订购于北京擎科生物科技有限公司。小动物超声机购自加拿大Fujifilm公司，Western blot电泳、转膜及成像系统均购于美国Bio-Rad公司，共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司。

1.3 小鼠MI模型建立及实验分组

小鼠随机分为两组:一组进行MI手术(n=20),一组进行假手术(n=10)。MI手术组小鼠用2%异氟醚麻醉，固定后从左侧第三和第四肋间开胸暴露心脏，用6-0丝线结扎冠状动脉左前降支，前壁变白提示冠状动脉结扎成功，术后将MI小鼠随机分为MI组和MI+HK组。假手术组(sham组)进行完全相同的手术操作，但是不结扎冠状动脉左前降支。MI+HK组于术后立即腹腔注射和厚朴酚(0.24 mg/kg)，每天1次，持续给药28 d。

1.4 观察指标及检测方法

所有实验室检测及观察指标均在假手术或MI手术后28 d时完成。

1.4.1 小动物心脏超声检测心脏功能 每组各8只小鼠用2%异氟醚麻醉，调整异氟烷剂量，保持小鼠心率在400～450次/min之间，小鼠固定于操作台上之后，通过VisualSonic VeVo 2100成像系统的经胸超声心动图进行评估，记录M型左室舒张末期内径和收缩末期内径，计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

1.4.2 Miller导管检测小鼠心脏功能 每组各4只小鼠用2%异氟醚麻醉后，从左侧颈部暴露左颈动脉，用动脉夹分别夹住近心和远心端，用显微剪剪出一个三角形切口，将Miller导管插入颈动脉，放松近心端夹子，将导管缓慢送入左心室，待信号稳定几分钟后，记录左心室舒张末压力(LVEDP)、左心室收缩末内径(LVESD)和舒张末内径(LVEDD)，计算左心室内压力上升的最大速率(dP/dtmax)。

1.4.3 心脏质量与胫骨长度比值计算 异氟烷麻醉小鼠后从颈部抽取血液。剪开小鼠胸部皮肤及肋骨，从主动脉根部逆灌生理盐水冲洗干净残余的血液后，吸干水分，对心脏进行称量并记录心脏质量；分离小鼠胫骨并测量其长度。每组各6只小鼠，计算心脏质量与胫骨长度比值(HW/TL)。

1.4.4 Masson染色检测心脏纤维化 异氟烷麻醉小鼠后从颈部抽取血液。剪开小鼠胸部皮肤及肋骨，从主动脉根部逆灌生理盐水冲洗干净残余的血液后将心脏置于4%多聚甲醛过夜。经过石蜡包埋、切片、脱蜡后，进行Masson染色，用ImageJ软件测量纤维化，以占左心室总面积的百分比计算。

1.4.5 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡 异氟烷麻醉小鼠后从颈部抽取血液，剪开小鼠胸部皮肤及肋骨，从主动脉根部逆灌生理盐水冲洗干净残余的血液后，取心脏组织进行4%多聚甲醛固定、石蜡包埋和切片，脱蜡后，按照试剂盒说明书，进行TUNEL试染色，使用Image J软件计算凋亡细胞百分比。

1.4.6 蛋白质免疫印记检测Bcl-2和Bax的表达量 取小鼠心脏从左心室提取总蛋白，蛋白样品的浓度用BCA法进行检测定量，通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离提取和定量的蛋白质，并将其转移到PVDF上，用含5%脱脂奶粉和0.1%吐温-20的封闭液室温下对PVDF膜封闭2 h，随后，将PVDF膜与适当的一抗抗体(抗Bcl-2抗体和抗Bax抗体均按照1 ∶1 000进行稀释，抗GAPDH抗体按照1 ∶2 000进行稀释)在4 ℃下孵育过夜，室温条件下用相应的辣根过氧化物酶结合二抗孵育PVDF膜，滴加增强化学发光(ECL)试剂，用ChemiDocTMXRS进行成像，使用与成像仪配套的Image Lab 5.0软件对蛋白条带进行相对定量分析。

1.4.7 定量聚合酶链式反应检测纤维化相关分子的转录量 异氟烷麻醉小鼠后取心脏组织，用PBS冲洗后，左心室切下一小块组织，放入含有Trizol试剂的Ep管中，参照RNA提取说明书，从样本中提取总RNA，测定浓度后，将RNA反转录成cDNA，使用CFX96实时定量PCR仪定量，以GAPDH作为内参基因。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 和厚朴酚改善小鼠MI后心脏功能

小鼠MI手术后28 d，通过小动物超声和Miller导管对小鼠心脏功能进行评估，结果见图1。与sham组相比，MI组小鼠的LVEF显著降低，LVEDP显著升高，dP/dtmax显著降低(均P<0.001)；与MI组相比，MI+HK组小鼠的LVEF显著升高(P<0.05)，LVEDP显著降低(P<0.001)，dP/dtmax显著升高(P<0.05)。以上结果表明MI小鼠经过给予和厚朴酚处理后，心脏功能有显著的改善，和厚朴酚具有MI后心脏保护作用。

与sham组相比，***P<0.001；与MI组相比，#P<0.05，###P<0.001图1 和厚朴酚对MI小鼠心脏功能的影响 (n=8或n=4)Figure 1 Effects of honokiol on cardiac function in MI mice (n=8 or n=4)

2.2 和厚朴酚减轻小鼠MI后心室重构

MI术后28 d，与sham组相比，MI组小鼠HW/TL显著升高(P<0.01)，LVESD和LVEDD也显著增加(均P<0.001，见图2)，这提示MI术后小鼠的心脏出现显著的肥厚以及左心室扩大；与MI组相比，MI+HK组小鼠的HW/TL、LVESD和LVEDD均有所降低(P<0.05，见图2)，这表明MI引起的肥厚和扩大得到了一定程度的抑制。以上结果表明和厚朴酚减轻了心肌梗死后小鼠心室重构。

2.3 和厚朴酚减轻小鼠MI区远端纤维化

MI术后28 d，对小鼠心脏进行固定并行Masson染色。梗死远端区域Masson染色典型图显示，MI组梗死远端区域胶原沉积显著，而经过和厚朴酚治疗后，胶原沉积有所减轻(见图3)。采用Image J对梗死远端区域进行纤维化定量计算，与sham组相比，MI组小鼠的梗死远端纤维化指数显著增加(P<0.001)；而和厚朴酚治疗后，心梗小鼠梗死远端纤维化指数从(20.65±0.98)%下降到(10.53±0.87)%(P<0.001，见图3)。这表明和厚朴酚减少了MI后小鼠左心室的胶原沉积，抑制了左心室的不良重构。

2.4 和厚朴酚降低梗死边缘区域心肌细胞的凋亡

MI发生后，梗死区域心肌细胞大量死亡，而梗死边缘区域的心肌细胞也会持续凋亡。术后心脏细胞的凋亡情况通过TUNEL染色进行定量检测。TUNEL染色典型图见图4。与sham组相比，MI后小鼠心脏梗死边缘组织心肌细胞有明显的凋亡(P<0.001)，而经过和厚朴酚治疗后，心肌细胞的凋亡受到了抑制，凋亡比例由(7.52±0.15)%下降到(3.54±0.09)%(P<0.001，见图4)。

与sham组相比，**P<0.01，***P<0.001；与MI组相比，#P<0.05图2 和厚朴酚对小鼠心肌梗死后心室重构的影响 (n=6或n=8)Figure 2 Effects of honokiol on ventricular remodeling in MI mice (n=6 or n=8)

与sham组相比，***P<0.001；与MI组相比，###P<0.001图3 和厚朴酚对小鼠心脏梗死区远端纤维化的影响 (Masson染色×40，n=6)Figure 3 Effect of honokiol on fibrosis in the remote region after MI (Masson staining×40，n=6)

图4 和厚朴酚对梗死边缘区域心肌细胞的凋亡的影响 (TUNEL染色，n=8)Figure 4 Effect of honokiol on the apoptosis of cardiomyocytes in the border region (TUNEL staining，n=8)

2.5 和厚朴酚降低MI小鼠心脏纤维化及凋亡分子的转录和表达

进一步研究表明，与sham组相比，MI小鼠心脏纤维化关键分子Tgfb1、Col1a1和Acta2的转录量在心梗后分别上升到3.57倍，2.05倍和3.01倍(均P<0.001)；而经过治疗后，与MI组相比，和厚朴酚组小鼠心脏中前述3种纤维化相关分子的转录量分别下降23.25%，23.41%和26.57%，均具有统计学差异(见图5)。此外，与MI组相比，和厚朴酚组小鼠梗死心脏中的凋亡相关分子Bax/Bcl-2的比值也显著降低(P<0.05，见图5)。

与sham组相比，***P<0.001；与MI组相比，#P<0.05，##P<0.01图5 和厚朴酚对MI小鼠心脏纤维化及凋亡分子的转录和表达的影响 (n=4)Figure 5 Effects of honokiol on the transcription and expression of cardiac fibrosis and apoptosis molecules in MI mice (n=4)

3 讨论

随着科技的进步，急性MI后患者有药物、溶栓、经皮冠状动脉介入治疗以及冠状动脉旁路移植术等多种治疗策略可供选择，但是急性MI患者的1年病死率仍有28%[1]。所以，研究MI后的心脏保护研究依旧迫切。本研究发现中药有效成分—和厚朴酚对MI后心脏功能具有保护作用，有望为MI的防治提供新的治疗策略。

传统中医药中，厚朴可以用于消除胸闷和腹部紧绷，促进血液循环。厚朴含有生物碱、皂苷以及酚类等多种活性物质[7]。和厚朴酚是一种木脂素，与厚朴酚、4-O-甲基和厚朴酚和倒卵醇一起被认为是木兰植物中的主要生物活性化合物之一[8]。研究表明，和厚朴酚具有抗氧化、抗炎、肾脏保护、肝脏保护、神经保护、心血管保护、抗肥胖、抗糖尿病和抗癌等多种功能和活性[3,9-11]。此外，和厚朴酚可以轻易地穿过血脑屏障和血脑脊液屏障，成为具有高生物利用度的有效候选药物。已经有研究报道和厚朴酚具有心血管保护作用[12]，但是目前尚未有关于和厚朴酚在MI后心脏保护中的作用的报道。在本研究中和厚朴酚对MI小鼠心脏功能的保护作用得到了证实：通过给予和厚朴酚，MI小鼠的心脏功能得到了改善，具体表现在左心室射血分数的提高、左心室收缩末压力的下降以及等容收缩期左心室内压力上升的最大速率的提高。

和厚朴酚的生物活性与激活胞内多种信号通路相关。和厚朴酚通过激活SIRT1/Nrf2信号通路改善I型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤[6]。在此过程中，和厚朴酚激活SIRT1，增强Nrf2核易位，增加抗氧化能力，减少细胞凋亡[6,13]。此外，和厚朴酚在脑缺血或脑缺血发作后至少有5 h的治疗时间窗，这可能部分是由于突触后密度蛋白95(PSD95)与神经一氧化氮合成酶(nNOS)相互作用而破坏NO的生成，从而抑制神经毒性NO的生成相关[4]。和厚朴酚可以扩张血管，这可能是其通过抑制RhoA/Rho激酶信号通路实现的[14,15]，和厚朴酚能够通过抑制RhoA的激活和随后肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1(MYPT1)的磷酸化，抑制U46619和氟化钠引起的血管收缩[15]。长期服用和厚朴酚可通过增加NO生成降低自发性高血压大鼠(SHR)的收缩压[14]。随着NO的释放，和厚朴酚可以抑制血小板聚集，从而抑制动脉的血栓形成[16]。对于动脉粥样硬化，和厚朴酚通过抑制ERK/NF-κB途径有效抑制TNF-α诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞迁移和细胞外基质蛋白酶的表达[17]。在心血管疾病方面，和厚朴酚可以减轻心肌缺血/再灌注损伤，降低血压，并产生抗动脉粥样硬化作用。本研究中在体动物实验结果表明，和厚朴酚减轻MI小鼠心脏与胫骨长度比值的下降、收缩末内径和舒张末内径，即心室重构的减轻。病理学角度和厚朴酚减轻了梗死远端心肌间质纤维化指数以及减少梗死边缘组织心肌细胞的凋亡。胞内分子方面和厚朴酚抑制心肌梗死小鼠心脏纤维化关键分子Tgfb1、Col1a1和Acta2的转录以及促凋亡分子Bax的表达，促进了抗凋亡分子Bcl-2的表达。但是，和厚朴酚对小鼠MI心脏的保护作用的完整分子机制还不明确。本研究证实，和厚朴酚能够改善MI后小鼠的心脏功能，降低梗死心脏远端区域的间质纤维化，减少梗死边缘区域心肌细胞的凋亡。综上所述，本研究结果表明和厚朴酚对梗死后小鼠心脏具有保护作用：和厚朴酚能够改善MI后小鼠的心脏功能，减轻心脏的肥厚和纤维化沉积，抑制梗死边缘区域心肌细胞的凋亡。本研究证实了HK对心肌梗死后小鼠心脏的保护作用，但是未能对其内在的分子机制进行阐明，这是本研究的局限性。在未来的研究中，结合在体动物和离体细胞对HK保护心梗后小鼠心脏进行进一步探讨，全面揭示内在分子机制，有望为和厚朴酚这一传统中药的有效成分成为改善MI患者心功能的潜在临床新药物提供理论基础。