关岭县水产养殖环节中霍乱弧菌污染状况调查

刘定相 张 倩 张 田 余 霞

（1.安顺市疾病预防控制中心，贵州 安顺 561000）

（2.关岭自治县疾病预防控制中心，贵州 安顺 561300）

前言

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜，共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱，分布于水生环境、鱼虾中，能够导致鱼类等水生动物的死亡，人可通过食用霍乱弧菌污染的鱼虾引起霍乱。气单胞菌属广泛分布于自然界，可从水源、土壤以及人的粪便中分离，一定条件下能够感染水产动物，导致出血病、溃疡综合征、赤皮、肠炎等疾病，对水产养殖业造成极大的经济损失，也可引起人类腹泻等多种感染。近年来贵州省外仍有水产动物养殖环节中存在霍乱弧菌、气单胞菌污染的报道。贵州省内有市售水产品中霍乱弧菌污染方面的报道，并无水产养殖霍乱弧菌、气单胞菌污染的调查报道。

目前，关岭自治县正大力发展水产养殖，积极探索乡村振兴策略，为了解关岭县水产养殖环节中霍乱弧菌、气单胞菌污染状况，为本地区水产养殖业防治霍乱弧菌、气单胞菌和降低因食用污染的水产动物引起食源性疾病风险提供科学依据。

1.材料与方法

1.1 标本来源

实验样本来自关岭自治县城区周边水产动物养殖户池塘或水库的养殖水体、污泥及水产动物样本共计62份。

1.2 方法

依据国家食品安全评估中心发布的《2020年国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》中《霍乱弧菌检验标准操作程序》和《致病性嗜水气单胞菌检验方法》（GB/T 18652-2002）对样本进行霍乱弧菌、气单胞菌的培养、分离，结合梅里埃公司VITEK 2 Compact30全自动微生物生化鉴定系统对细菌进行鉴定；运用实时荧光PCR技术测定霍乱弧菌CTXAB毒力基因。

1.3 主要仪器

电热恒温培养箱、生物安全柜、生物显微镜、VITEK 2 Compact30全自动微生物生化鉴定系统、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪。

1.4 主要试剂

3%氯化钠碱性蛋白胨水、氧化酶试纸、嗜盐性胰胨水（含氯化钠0%、6%、8%、10%）、革兰染液（由广东环凯微生物科技有限公司生产），科玛嘉弧菌显色培养基（由上海欣中生物工程有限公司生产），麦康凯琼脂培养基（由广东环凯微生物科技有限公司生产），GN鉴定卡（梅里埃生物科技有限公司生产），霍乱弧菌诊断血清（由杭州天润生物制品公司生产），霍乱弧菌CTXAB核酸检测预分装试剂盒（由深圳生科原生物有限公司生产），所使用试剂均在有效期内。

1.5 统计分析

将调查监测结果录入计算机建立数据库，利用SPSS 24.0对水产养殖水、污泥、水产动物样本中霍乱弧菌、气单胞菌的检出率进行统计分析。

2.结果

2.1 霍乱弧菌检测情况

2020-2021年关岭自治县城区周边水产动物养殖户池塘养殖水、污泥、水产动物样本进行霍乱弧菌检测，不同水产养殖样本霍乱弧菌检出情况见表1。

表1 不同水产养殖样本中霍乱弧菌检测情况

数据显示，养殖水、污泥、水产动物62份样本中有2份检出霍乱弧菌，总检出率3.23%（2/62）。23份养殖水中1份检出霍乱弧菌，检出率4.35%（1/23）；23份污泥样本中1份检出霍乱弧菌，检出率4.35%（1/23），水产动物样本中未检出霍乱弧菌。养殖水、污泥、水产动物三类样本中霍乱弧菌的检出率存在统计学差异（χ2=6.000，P=0.05）。

2.2 气单胞菌检测情况

对2020-2021年关岭自治县城区周边水产动物养殖户池塘养殖水、污泥、水产动物样本进行气单胞菌检测，不同水产养殖样本气单胞菌检出情况见表2。

表2 不同水产养殖样本中气单胞菌检测情况

监测数据显示，养殖水、污泥、水产动物62份样本中有2份检出气单胞菌，总检出率3.23%（2/62）。23份养殖水中2份检出气单胞菌，检出率8.70%（2/23）；污泥、水产动物样本中均未检出气单胞菌。养殖水、污泥、水产动物样本中气单胞菌的检出率存在统计学差异（χ2=6.000，P=0.05）。

2.3 霍乱弧菌相关检测情况

使用霍乱弧菌诊断血清对环境样本分离的霍乱弧菌进行血清学分型，运用实时荧光定量PCR技术对霍乱弧菌是否携带CTXAB毒力基因进行定性测定。

2.3.1 霍乱弧菌血清学分型。对同一个养殖点环境样本中分离的2份霍乱弧菌进行血清分型，霍乱弧菌血清学玻片凝集结果显示，2份霍乱弧菌对多价O1群诊断血清出现凝集现象，稻叶型、小川型、彦岛型及O139群诊断血清均未出现凝集现象，菌株鉴定均为O1群非稻叶型、非小川型、非彦岛型霍乱弧菌。无菌生理盐水组无凝集现象。结果见表3。

2.3.2 霍乱弧菌毒力基因检测。利用实时荧光定量PCR技术对分离出的2份霍乱弧菌进行CTXA毒力基因定性测定，结果均为阴性。无菌生理盐水组为阴性。结果见表3、表4。

表3 2份霍乱弧菌血清学分型及毒力基因检测情况

表4 2份霍乱弧菌CTXAB毒力基因实时荧光PCR定性检测曲线图

结果显示，环境样本中分离的2份霍乱弧菌为01群霍乱弧菌，均未携带CTXAB毒力基因。

3.讨论

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是革兰氏染色阴性，弯曲或呈逗点状的需氧杆菌，广泛分布在水生环境中，是水产动物养殖中常见的致病菌，大量繁殖可导致养殖的水产动物出现病变、死亡，人因食用被污染的水产动物易引起霍乱。本次监测的62份样本中，2份样本检出霍乱弧菌（检出率3.23%），是关岭县首次在水产养殖环境中检出嗜盐性弧菌，可能与霍乱弧菌的生长特性有关，霍乱弧菌在无盐或低盐、PH8.8-9.0的水环境中生长良好，关岭县属于淡水较丰富的地区，多数水环境pH酸碱度接近中性，养殖环境仍存在符合霍乱弧菌生长的条件，因此，相关部门应加强对水产养殖的关注。

CTXAB基因是霍乱弧菌霍乱毒素的编码基因，携带CTXAB毒力基因的霍乱弧菌容易导致水产养殖动物病变、死亡，可引起人类肠道疾病霍乱的发生。本次污染状况调查发现，污染养殖环境中的O1群霍乱弧菌均未携带CTXAB毒力基因，说明养殖环境中霍乱弧菌这与李成伟、李涛、刘祥亮等调查一致。

气单胞菌广泛分布于自然界的土壤、水环境中，属于条件致病菌，主要感染鱼类、两栖类、爬行类、哺乳类等多种动物，同时也是畜禽、水产等肉类食品重要的传染源。水产动物因生活在水环境中，当出现养殖水质恶化、机体损伤等，较易遭受感染。本次调查结果显示，62份样本中2份样本检出气单胞菌，检出率3.23%，污泥、水产动物样本未检出气单胞菌，提示水产动物养殖环境已被气单胞菌污染，因此，弄清污染来源对采取针对性防控措施具有重要意义。

如今，国内交通、物流行业日益发达，内陆与沿海地区物品流通频率高，可能存在从沿海地区购入水产养殖鱼、虾苗情况，霍乱弧菌可能会从沿海地区向内陆蔓延，会成为影响关岭县食品安全的风险因素。本次对水产养殖环节中养殖水、污泥、水产动物三类样本进行霍乱弧菌污染状况的检验，2份样本检出霍乱弧菌，霍乱弧菌检出样本为同一鱼类养殖点，为有流动水源少量流入的鱼类养殖池塘，采样前有外购鱼苗入塘情况，后续出现鱼类死亡现象。本次调查中，由于未采集到流入水源样本和鱼标本，不能充分分析出霍乱弧菌污染唯一来源，但该养殖池塘的水体、污泥均有检出霍乱弧菌，说明养殖环节存在霍乱弧菌污染的风险。

综上所述，关岭县水产养殖水、污泥等环境样本中存在霍乱弧菌、气单胞菌的污染，相关部门应高度关注，持续加强对水产养殖各环节、水环境中气单胞菌、霍乱弧菌污染及毒力状况、药物敏感性监测，以及时采取措施，减少关岭县水产养殖户的经济损失，降低因食用霍乱弧菌、气单胞菌污染的水产动物引起食源性疾病等的传播风险。