贵州地区基因分型指导下非瓣膜性房颤患者华法林预测模型的建立

徐诗佳、崔淼淼 许木丽 朱小涵 韦灵 侯淑敏 赵可仙 唐峰△

(1.贵阳市第二人民医院心内科,贵州 贵阳 550004；2.贵阳市第二人民医院检验科,贵州 贵阳 550004)

心房颤动(简称房颤)可导致左房血栓形成，栓子脱落可引起动脉栓塞，以脑卒中危害最大[1]。华法林一直是临床应用最广泛的口服抗凝药[2]。非瓣膜病房颤(NVAF)研究荟萃分析结果示，华法林可使卒中的相对危险度降低64%，全因死亡率降低26%[3]。华法林在临床用药过中存在治疗窗狭窄、个体差异大、影响因素多、需频繁抽血化验等问题[4]，如何安全、快速地达到稳定剂量一直是华法林抗凝研究的热点。近年的研究发现VKORC1和CYP2C9基因多态性与华法林稳定剂量的个体差异密切相关,大约可以解释30%的差异，其中VKORC1解释20%～25%，CYP2C9可以解释5%～10%[5]。为了实现个体化用药，减少不良反应，华法林稳定剂量预测模型成为另一个研究热点。随着我国人口老年化的发展，非瓣膜性房颤患者正逐年增多，华法林给药模型应根据区域人群不同而逐渐细化，建立起适合不同种族、区域的NVAF患者华法林的治疗模型。我国目前对华法林稳定计量预测模型及公式的研究以北方沿海地区为主，贵州属于少数民族聚居地，有其独特的地理条件及生活习惯，且不同的族群具有不同的基因多态性频率，因此建立适合贵州地区的NVAF患者华法林日均剂量给药公式，可让更多贵州地区患者受益。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年5月至2019年5月我院收治的150例NVAF患者。入选标准：贵州地区人群(三代以内在本地居住)，年龄≥18岁；非瓣膜性房颤；CHA2DS2-VASc评分≥2；HAS-BLED评分≤2分；服用华法林>2个月，INR达标。排除标准：INR未达标；CHA2DS2-VASc<2；严重肝肾功能不全、颅内出血史、妊娠、严重感染、严重心衰、贫血、恶性肿瘤、血液疾病、华法林过敏史、活动性消化性溃疡。CHA2DS2-VASc评分标准：近期心力衰竭1分，高血压病1分，年龄64～74岁1分，年龄75岁2分，糖尿病1分，脑卒中/短暂性脑缺血发作/血栓栓塞病史2分，血管疾病(如陈旧性心肌梗死、周动脉疾病、主动脉斑块)1分。本试验经医院伦理委员会同意，入选患者均签署书面知情同意书。

1.2患者信息记录 收集患者的年龄、性别、民族、身高、体质量、体表面积BSA、BMI、高血压病史、糖尿病病史、华法林稳定日均剂量及CYP2C9和VKORC1基因型。

近两年来，农业农村部（原农业部）和云南省委、省政府高度重视云岭牛产业发展，将云岭牛产业列入我省草食畜产业的重中之重予以精心培植，编制并印发了“十三五”云岭牛产业发展规划，进一步明确了发展思路、原则、目标及措施。全省多个地方已将云岭牛产业列入当地现代农业发展的重点产业和脱贫摘帽的优质产业来抓。

1.3INR达标标准 所有患者均采用初始剂量2.5 mg/d,随后持续监测国际标准化比值(INR)，该值连续3次检测达到2.0～3.0即可达标，70岁以上的老年患者INR的标准是1.6～2.6。

2.2患者临床特征与华法林稳定剂量的关系 通过统计学软件对影响华法林稳定剂量的相关临床因素进行分析，其结果如表1、表2所示，由此可见，华法林稳定剂量分别与患者民族、年龄、体质量、BSA、吸烟史相关(rs分别为0.273、-0.713、0.190、0.199、0.176，P均<0.05)，与患者性别、饮酒史、高血压病史、糖尿病病史、身高均不相关，差异均无统计学意义(P>0.05)。针对不同民族间华法林稳定剂量差异比较的事后检验证明，汉族华法林稳定剂量明显低于布依族(P=0.001)和苗族、侗族等其他民族(P=0.031)，布依族和其他少数民族之间的华法林稳定剂量无明显差异(P=0.791)。年龄和华法林稳定剂量呈负相关，年龄越大，华法林稳定剂量越低。体质量、BSA和法林稳定剂量均呈正相关，体质量、BSA越大，华法林稳定剂量越高。有吸烟史的病例华法林稳定剂量明显高于不吸烟的。

1.4.2基因检测方法 抽取合格入选患者的外周静脉血于枸橼钠抗凝抽血管内，采用血液基因组柱式小量提取试剂盒提取基因组DNA，用人类CYP2C9和VKORC1基因检测试剂盒在实时荧光定量PCR仪中进行CYP2C9 和VKORC1基因型测定，剩余DNA置于-80℃冰箱内保存备用。采用25ul的PCR-荧光探针法反应体系：23ul的反应液+2ul的基因组DNA。扩增程序：37℃ UNG处理10 min 1个循环；95℃预变性5 min 1个循环；95℃变性15 s，62℃退火延伸60 s，共40个循环，通过采集荧光信号判断基因型。

1.4.1药品试剂与仪器 华法林药片(齐色制药有限公司,国药准字H37021314)，实时荧光定量PCR扩增仪(上海透景生命科技股份有限公司)，血液基因组柱式小量提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技有限公司)，人类CYP2C9和VKORC1基因检测试剂盒(武汉友芝友医疗科技股份有限公司)，无水乙醇。

2 结 果

2.1患者基本情况分析 根据设定的标准，纳入150例患者，其中男79例(52.66%)，女71例(47.34%)，平均年龄(71.83±10.59)岁，平均身高(160.73±7.76)cm，平均体质量(60.46±11.93)kg，平均BSA(1.61±0.20)m2，平均BMI(23.29±3.61)kg/m2，饮酒44例(29.33%)，吸烟54例(36.00%)，高血压77例(51.33%)，糖尿病42例(28.00%)。

影像学指标包括测量的颈椎生理曲度（Cobb角）和颈椎活动度（ROM）（颈椎动力性摄片测量法，将过伸和过屈位X线片上的Cobb角绝对值相加）。随访时如果过屈过伸位片上相邻棘突间距改变＜2 mm、侧位片上假体和相邻椎体间没有透亮线、侧位片及CT上可见骨小梁通过假体与邻近终板，可以认为已达到融合标准。

1.4研究方法

表1 不同民族、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史及饮酒史的华法林稳定剂量比较

表2 各影响因素和华法林稳定剂量的相关分析

邀请3位专家给出杭州市运河引配水系统指标体系（表1）中各个因子的两两判断矩阵，计算各因子主观权重及相应的专家自身权重，融合得到各因子权重。

2.3.1CYP2C9和VKORC1基因型频率符合Hardy-weinberg平衡，差异无统计学意义(P>0.05),表明该研究人群具有代表性。

小组合作学习模式中最重要的是小组成员的分配。合作小组并不是单纯地将位置紧挨在一块的学生组建起来。合理的分配小组成员，组建积极和谐有影响力的小组队伍是至关重要的。因此，在语文课程学习中，教师在分配组建小组时，一定要根据组内异质，组间同质的分组原则，将学生的整体学习能力、学习状况、家庭情况、爱好兴趣、性格优势等多方面情况综合考虑，合理有效地搭配小组成员。通过这样的小组分配方式，不仅充分考虑到小组成员之间的差异化存在，而且使小组成员之间能够进行优势互补、相互协调，更加有利于促进小组间的和谐合作。

2.3.3CYP2C9和VKORC1基因型在不同民族的分布情况 汉族、布依族及其他民族基因频率以AA型为主，AC型较为少见，未出现过CC型，等位基因频率以A型为主，C型所占比重少。以上各组的 CYP2C9基因型及等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。汉族基因频率以AA型为主，GA型较AA型少，GG型未出现；布依族AA和GA型相当，GA型多于AA型，GG型未出现；其他民族以AA和GG为主，AA型多于GG型，GA型未出现。以上各组的VKORC1基因型及等位基因分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、表4。

道路是国有林场林区生产生活的基础性、先导性服务设施，是国有林场林区经济社会转型发展的重要推动力，是改善民生、脱贫致富的重要手段，对保障生态安全和社会稳定十分重要。中发[2015]6号文件明确提出“各级政府要将国有林场林区道路按属性纳入相关公路网规划”，“国家结合现有渠道，加大对国有林区基础设施建设的支持力度”等具体要求。因此，通过对道路发展现状和存在问题的分析，将为国有林场林区道路建设与发展，努力改善国有林场林区道路交通条件，提高交通服务能力和水平，提供基础依据，为政策的制定提供可靠的遵循。

2.3患者基因型与华发林稳定剂量的关系

2.3.2不同基因型华法林稳定剂量比较 CYP2C9基因型 AA和AC华法林稳定剂量分别为(2.83±0.81)mg，(2.05±0.59)mg，AC型稳定剂量低于AA型，差异有统计学意义(P<0.05)；VKORC1 AA、GA、GG型华法林稳定剂量分别为(2.58±0.62)mg，(3.24±1.16)mg，(4.44±0.97)mg， AA型华法林稳定剂量低于GA、GG型，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 CYP2C9在不同民族的基因型频率分布

表4 VKORC1在不同民族的基因型频率分布

2.3.4基因型结果的判断 该研究主要运用实时荧光定量PCR扩增仪(上海透景生命科技股份有限公司，SLAN-96)对CYP2C9和VKORC1基因进行多态性检测，一个反应体系通过两种不同的检测通道检测一个基因位点的多态性(FAM通道采集蓝色荧光，表示野生型位点，VIC通道采集绿色荧光，表示突变型位点，同时还需一个ROX通道，主要用于采集橙色荧光，表示内标基因)。在反应体系中含有不同基因型模板的情况下，PCR反应得以进行并释放不同的荧光信号，利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，从而进行结果的分析。见图1，图2，图3。

2.4模型的建立 根据前文华法林稳定剂量影响因素相关分析结果，进一步使用线性回归分析对影响因素进行定量探究，构建线性回归模型成立(F=49.183，P<0.001)，模型R2=0.680，说明构建的模型能解释68.0%的原始信息，证明模型构建比较合理。回归分析结果显示：华法林剂量=6.843+0.190×民族-0.058×年龄-0.024×体重-1.033×CYP2C9+0.719×VKORC1。对于民族，当患者为汉族时为1，布依族时为2，其他民族时为3；对于CYP2C9，AA时为1，AC时为2；对于VKORC1，AA时为1，GA时为2，GG时为3。

表5 患者华法林剂量影响因素分析

2.5预测剂量与实际剂量的对比 采用配对样本t检验的方法比较华法林的实际剂量与本研究所建立模型的预测剂量，结果显示华法林的实际剂量为(2.75±0.82)，模型预测剂量为(2.74±0.74)，与实际剂量相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

华法林是一种维生素K拮抗剂，进入体内即可被吸收，并具有良好的生物利用度,临床上常用来治疗和预防血栓性疾病，影响华法林的因素分为非遗传因素和遗传因素[6]。遗传因素主要与CYP2C9和VKORC1基因有关，其中CYP2C9是细胞色素氧化酶P450超家族中第二亚家族中的重要成员，位于染色体10q24[7]，作为华法林的代谢位点参与抗凝过程，其编码区的单核苷酸多态性(SNPs)决定了该基因具有高度多态性，最常见的突变是1075位的A碱基替换为C碱基(1075A>C)，导致终止密码提前出现，亮氨酸突变为异亮氨酸[7]，使酶的活性降低，延迟了华法林的清除代谢。该位点最常见的突变是CYP2C9*3和CYP2C9*2，亚洲人最常见的是CYP2C9*3，而CYP2C9*2极为少见[8]。VKORC1是维生素K环氧化物还原酶复合体的第一个亚基，位于16p11.2[7]，作为华法林的作用位点参与抗凝过程，该基因的编码区和非编码区均存在影响华法林剂量的多态性位点，最常见的突变是1639位的G碱基替换为A碱基(1639G>A)，该突变将导致维生素K依赖的凝血因子缺乏和华法林抵抗[9]，该基因突变与种族关系密切，亚洲人AA基因型频率最高(86%)，欧洲人居中(37%)，非洲人最低(10%)，GA及GG与高剂量华法林有关，这也在一定程度上解释了亚洲人所需华法林剂量较低有关[10]，维吾尔族和高加索人群的突变率低于汉族人群[11]。本研究共纳入150名贵州地区NVAF患者，并结合患者的性别、年龄、身高、体重及吸烟史等临床特征和其遗传因素，通过多元线性回归分析建立了华法林剂量预测模型，可以解释临床上68%的华法林差异。本研究所建立的模型共纳入的影响因素中，性别、身高、BMI、BSA、吸烟史、饮酒史、高血压史及糖尿病史对华法林剂量无显著影响，但吴超君等模型[11]认为华法林稳定剂量与BSA呈正相关，而范芳芳等模型[12]还认为有吸烟史的需要更高的华法林剂量。这可能与纳入的标本量少有关，需要进一步增加样本量进一步研究。年龄与华法林稳定剂量呈负相关，随着年龄的增长，人体的身体机能也会随之衰退，肝脏清除功能和肾脏排泄功能减退，从而导致华法林代谢速率和清除速率减慢，需要的维持剂量也因此减少，而且年龄越大，对华法林的敏感性越高，抗凝治疗风险越大，几乎所有的模型都能证实这个观点。在本研究中，体质量与华法林稳定剂量成负相关，与肖成等模型[7]与华法林稳定剂量呈正相关、Tejasvita Gaikwad模型[13]体质量对华法林稳定剂量无显著影响不同，可能与纳入不同民族、地域差异及标本量例数较少相关。该研究中，民族与华法林剂量呈正相关，少数民族患者需要更高的华法林稳定剂量，根据统计学计算，CYP2C9基因在汉族和少数民族之间无统计学意义，但VKORC1基因具有统计学意义，说明少数民族VKORC1基因型突变率不同于汉族，在针对新疆维吾尔族建模的范芳芳等模型[12]中，VKORC1基因型以GA型为主，占比47.8%，突变率低于汉族人群，贵州作为一个少数民族聚集地，少数民族种类多，也有相应的趋势，但该研究纳入少数民族病例比例少，无法对改因素进行系统的分析。华法林稳定剂量相关的遗传因素主要是CYP2C9及VKORC1的基因多态性引起的，在本研究中，纳入的150例标本中，CYP2C9 AA基因型共133例(88.67%)，AC基因型17例(11.33%)，未出现CC型，华法林稳定剂量分别为(2.83±0.81)mg，(2.05±0.59)mg，AA型华法林稳定剂量明显高于AC型，携带一个突变基因，所需华法林稳定剂量可显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；VKORC1 AA基因型共有117例(78.0%)，GA基因型31例(20.67%)，GG基因型2例(1.33%)，突变率低于肖成等模型[7]，而明显低于范芳芳等模型[12]，VKORC1AA、GA、GG各基因型华法林稳定剂量分别为(2.58±0.62)mg，(3.24±1.16)mg，(4.44±0.97)mg，AA型华法林稳定剂量明显低于GA基因型和GG基因型，携带突变基因的个体所需较低的华法林稳定剂量，差异有统计学意义(P<0.05)。该模型的建立在一定程度上优化了华法林用药方案，可缩短患者达到稳定剂量的时间，并减少副作用的风险，能较好的指导华法林的临床用药。

但本研究有样本量偏少、纳入的少数民族样本量少、缺乏临床验证等局限性，因此需要进一步增加样本量、纳入更多少数民族样本或针对性的研究某个民族，观察更多的影响因素及遗传位点多态性，以使华法林在临床上的运用能更加精确有效。